Wczesna diagnoza natywnego i związanego z urządzeniem zapalenia opon mózgowych

Cel badania Ocena wydajności analitycznej i klinicznej (czułość, swoistość, dodatnia i ujemna wartość predykcyjna, dokładność) nowego, specyficznego dla patogenu biomarkera D-mleczanu w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) do diagnostyki i monitorowania leczenia natywnego i urządzenia -powiązane zapalenie opon mózgowych. Działanie D-mleczanu płynu mózgowo-rdzeniowego zostanie porównane z obecnie stosowaną konwencjonalną kulturą płynu mózgowo-rdzeniowego i biomarkerami, przy użyciu standardowych kryteriów definicji infekcji (zapalenie opon mózgowych natywne i związane z urządzeniem).

Konkretne cele

• Cel 1. Określenie skuteczności testu D-mleczanowego w diagnostyce zapalenia opon mózgowych związanego z urządzeniem i natywnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych w seryjnie pobranych próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego poprzez punkcję lędźwiową/komorową (przed lub śródoperacyjnie), drenaż komór zewnętrznych (EVD), drenaż lędźwiowy drenaż (ELD) i zasysanie bocznikowe.
• Cel 2. Ocena optymalnej wartości odcięcia testu D-mleczanu płynu mózgowo-rdzeniowego w diagnostyce zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych związanego z urządzeniem i natywnego przy użyciu istniejących kryteriów definicji.
• Cel 3. Ocena skuteczności testu D-mleczanowego w diagnostyce zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych związanego z urządzeniem i natywnego w porównaniu ze standardowymi badaniami (posiew, barwienie metodą Grama, liczba leukocytów w płynie mózgowo-rdzeniowym i różnicowanie, mleczan płynu mózgowo-rdzeniowego, glukoza w płynie mózgowo-rdzeniowym, glukoza w płynie mózgowo-rdzeniowym CSF total protein, multiplex PCR) oraz nowe biomarkery (prokalcytonina CSF, alfa-defensyna - ELISA, interleukina-6).

Badana populacja:

Uwzględnieni zostaną kolejni pacjenci z podejrzeniem zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych związanych z urządzeniem i natywnego zapalenia opon mózgowych leczonych w naszej placówce. Płyn mózgowo-rdzeniowy zostanie pobrany zgodnie z rutynową procedurą diagnostyczną. Podczas przeprowadzania tego badania nie będą wykonywane żadne dodatkowe badania inwazyjne ani nieinwazyjne. Wyniki uzyskane w tym badaniu klinicznym nie będą miały wpływu na decyzje diagnostyczne lub terapeutyczne pacjentów.

Definicje badań Zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych związane z urządzeniem zostanie zdefiniowane zgodnie ze zmodyfikowanymi kryteriami zakażeń szpitalnych opracowanymi przez Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (CDC).

Zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych lub zapalenie komór związane z urządzeniem musi spełniać co najmniej 1 z następujących kryteriów:

1. Odpowiedni wzrost patogenu w płynie mózgowo-rdzeniowym, na urządzeniu lub w wymazie z rany w miejscu wprowadzenia urządzenia.
2. Co najmniej jeden z następujących objawów bez innej możliwej do zidentyfikowania przyczyny: gorączka > 38°C, ból głowy, sztywność karku, objawy ze strony nerwów czaszkowych, drażliwość, zmniejszenie skali Glasgow (GCS) ORAZ co najmniej jedno z następujących wyników badań laboratoryjnych: zwiększona leukocyty w płynie mózgowo-rdzeniowym (>5 × 10^6/l), zwiększone białko całkowite w płynie mózgowo-rdzeniowym (>0,45 g/l) lub obniżony stosunek płynu mózgowo-rdzeniowego do glukozy we krwi (<0,5); pozytywny wynik barwienia metodą Grama płynu mózgowo-rdzeniowego ORAZ lekarz rozpoczyna terapię przeciwdrobnoustrojową.

Zastosowany zostanie następujący system klasyfikacji natywnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych:

Zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych rozpoznaje się, jeśli występuje co najmniej 1 z następujących kryteriów:

1. U pacjenta wyhodowano drobnoustroje z płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).
2. U pacjenta występuje co najmniej 1 z następujących objawów przedmiotowych lub podmiotowych: gorączka (>38°C), ból głowy*, sztywność karku*, objawy oponowe*, objawy dotyczące nerwów czaszkowych* lub drażliwość*

3. I co najmniej 1 z poniższych:

   1. zwiększona liczba krwinek białych, podwyższone stężenie białka i obniżona zawartość glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym
   2. organizmy obserwowane w barwieniu płynu mózgowo-rdzeniowego metodą Grama
   3. organizmy wyhodowane z krwi
   4. pozytywny wynik testu laboratoryjnego płynu mózgowo-rdzeniowego, krwi lub moczu

   5. diagnostyczne pojedyncze miano przeciwciał (IgM) lub 4-krotny wzrost w sparowanych surowicach (IgG) dla patogenu, a jeśli diagnoza zostanie postawiona przedśmiertnie, lekarz wdroży odpowiednią terapię przeciwdrobnoustrojową.

      • Bez innej rozpoznanej przyczyny

U pacjentów ze zdiagnozowanym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych natywnym lub związanym z urządzeniem początek zakażenia będzie określony przez cechy kliniczne, laboratoryjne i mikrobiologiczne.

Przeprowadzanie badania W zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych związanym z urządzeniem płyn mózgowo-rdzeniowy będzie pobierany przed, w trakcie lub po zabiegu chirurgicznym związanym z urządzeniem, zgodnie ze standardową praktyką. Nakłucia lędźwiowe/komorowe (przed, śród- i/lub pooperacyjne) oraz aspiracje komór zewnętrznych (EVD) i drenażu lędźwiowego (ELD) będą wykonywane przez neurologa lub neurochirurga zgodnie ze standardowymi technikami aseptycznymi.

U pacjentów z natywnym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych płyn mózgowo-rdzeniowy będzie pobierany przez nakłucie lędźwiowe, zgodnie ze standardową praktyką.

Procedura laboratoryjna

• Natychmiast po aspiracji 0,5-1 ml płynu mózgowo-rdzeniowego zostanie przeniesione do każdej z następujących fiolek:

  • natywna fiolka do kultury konwencjonalnej (płytka agarowa i bulion)
  • Fiolka z EDTA do oznaczania liczby i różnicowania leukocytów
  • butelka do posiewu krwi dla dzieci (BacTec PedsPlus/F)
  • natywna fiolka do wykrywania biomarkerów (np. D-mleczan, interleukina-6 prokalcytoniny, alfa-defensyna (ELISA) oraz testy dodatkowe (np. PCR)
• Test D-mleczanu zostanie przeprowadzony przy użyciu spektrofotometrycznego testu enzymatycznego zgodnie z instrukcjami producenta (D-Lactate Colorimetric Assay. Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) w następujący sposób: mieszanina reakcyjna zawierająca 10 µl próbek płynu mózgowo-rdzeniowego, 2 µl mieszanki substratów i 2 µl mieszanki enzymów oraz ślepa próba zawierająca tylko próbkę i mieszankę substratów zostaną przeanalizowane pod kątem każda próbka. Krzywa kalibracji z roztworami D-mleczanu (soli monolitu) w wodzie będzie przetwarzana w każdej partii. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 30 minut i określa absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika Microplate Absorbance Reader. Gęstość optyczna każdej próbki zostanie przeliczona na stężenie D-mleczanu w mmol.
• Badanie będzie wykonywane przez dwóch przeszkolonych asystentów technicznych laboratorium medycznego, którzy są dostępni przez 12 godzin w dni robocze.
• Wszystkie aspiraty płynu mózgowo-rdzeniowego i rosnące mikroorganizmy (w tym te wyhodowane z próbek śródoperacyjnych, takich jak tkanka wokół implantu lub płyn sonikacyjny) będą przechowywane w biobanku w temperaturze -70°C. Ten zbiór płynów i posiewów umożliwia późniejszą dodatkową analizę w celu zapewnienia prawidłowej diagnozy.

Analiza statystyczna:

W przypadku zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych związanego z urządzeniem przyjmuje się, że 30-40% próbek płynu mózgowo-rdzeniowego jest zakażonych, a różnica czułości między testami D-mleczanowymi i konwencjonalnymi wynosi 10% (90% dla testów D-mleczanowych i 80% dla testów konwencjonalnych). W przypadku natywnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych przyjmuje się, że 10% próbek płynu mózgowo-rdzeniowego jest zakażonych, a różnica czułości między testami D-mleczanowymi i konwencjonalnymi wynosi 20% (95% dla testów D-mleczanowych i 75% dla testów konwencjonalnych). Dowodem na to, że oba testy nie są gorsze, jest jednostronny dwugrupowy test wartości procentowych. Nie-gorszość określa się przy różnicy 10% i można ją wykazać dla zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych związanych z materiałem obcym u 458 pacjentów i dla natywnego zapalenia opon mózgowych u 198 pacjentów na poziomie istotności 5% i mocy 80%. Obliczenia mocy przeprowadzono za pomocą narzędzia nQuery Advisor 7.0. W zależności od typu skali danych, wyniki opisowe wyraża się jako średnią ± SD lub liczbę osób badanych (w procentach). Zmienne kategoryczne zostaną porównane, odpowiednio, przy użyciu x2 lub dokładnych testów Fishera. Zmienne ciągłe zostaną porównane za pomocą testu sumy rang Wilcoxona. Wartość p <0,05 będzie uważana za istotną statystycznie. Wyniki testu zostaną ocenione pod kątem czułości, swoistości, dodatniej wartości predykcyjnej, negatywnej wartości predykcyjnej, dokładności i istotności statystycznej zostaną ocenione za pomocą testu Chi-kwadrat McNemara lub testu dwumianowego w zależności od wielkości próby. Wszystkie wartości p z analiz wtórnych będą rozpatrywane w eksploracyjny sposób niepotwierdzający. Do analiz statystycznych zostaną użyte pakiety programów SPSS (SPSS 10.0 dla Windows, SPSS, USA) oraz pakiet programów R (najnowsza wersja w czasie analizy).

Badacze planują objąć łącznie 600 pacjentów z zapaleniem opon mózgowych związanych z urządzeniem i 220 pacjentów z natywnym zapaleniem opon mózgowych. Wysoka liczba przypadków jest wskazana, ponieważ badacze spodziewają się tylko 30-40% wskaźnika infekcji w przypadku zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych związanych z obcym urządzeniem i 10% wskaźnika infekcji w przypadku natywnego zapalenia opon mózgowych, a także 10-15% wskaźnika rezygnacji (np. brak liczby leukocytów lub posiewu).