Łączenie danych egzomu i transkryptomu w celu odkrycia genetycznych podstaw lissencephalies

Jak wspomniano wcześniej, lissencephalies mają silną podstawę monogenetyczną w przeciwieństwie do innych wad rozwojowych mózgu. Około 80% procent lissencephalies można zdiagnozować genetycznie za pomocą standardowego WES lub WGS.1 W pozostałych 20% procentach nierozwiązanych przypadków ilościowe sekwencjonowanie RNA może zrobić znaczną różnicę. Identyfikując wzorce ekspresji RNA w lissencephalies, postaramy się dostarczyć nierozwiązanych przypadków lissencephaly z diagnozą genetyczną. Diagnoza genetyczna jest ważna z punktu widzenia przewidywania związanych z tym problemów, obserwacji, rokowania, a w niektórych przypadkach planowania rodziny (np. genetyczne badania przedimplantacyjne). W tym badaniu zbadana zostanie również dodatkowa wydajność diagnostyczna sekwencjonowania RNA w lissencephalies i co za tym idzie w widmie MCD. Oraz, jeśli wskazano, wykonalność wdrożenia sekwencjonowania RNA w standardowej obróbce diagnostycznej.

Ze względu na silną bazę monogenetyczną można oczekiwać wysokiej skuteczności w identyfikowaniu nowych wariantów patogennych i adnotacji nowych genów. Te nowe warianty i adnotacje genów są niezbędne do lepszego zrozumienia pochodzenia i patofizjologii widma bezmózgowia i migracji neuronów.

Funkcjonalny wpływ nowo odkrytych genów można dalej badać za pomocą innowacyjnej metody CRISPR-Cas9. Ta technika edycji genów umożliwia naukowcom tworzenie genów typu knock-out lub nawet knock-in, co stanowi okazję do zbadania nowych genów z adnotacjami i ich konsekwencji funkcjonalnych. Chociaż wykracza to poza zakres tego badania, jest to interesująca pozycja dla przyszłych wspólnych projektów badawczych, w ramach naszej grupy badawczej lub we współpracy z innymi. Podczas tych badań sekwencjonowaniu RNA poddane zostaną także genetycznie zdiagnozowane przypadki bezmózgowia. Obecna klasyfikacja lissencephalies opiera się na patogennych wariantach i szlakach biologicznych. Zmiany we wzorze ekspresji RNA mogą prawdopodobnie rzucić nowe światło na tę klasyfikację.

W badaniu tym zostanie również ocenione, które tkanki do pobierania próbek najlepiej nadają się do ekstrakcji i sekwencjonowania RNA. Rozważania, które należy wziąć pod uwagę, obejmują docelową jakość ekstrahowanego RNA i różnice w tkankowo-specyficznej ekspresji genów. Zamiany ust, chociaż nieinwazyjne, nie nadają się do ekstrakcji RNA ze względu na naturalną florę jamy ustnej z wieloma wirusami i bakteriami (egzogenny materiał genetyczny). Uważa się, że RNA pochodzące z fibroblastów jest dobrej jakości, ale wymagana jest biopsja skóry, która jest uważana za stosunkowo inwazyjną. Krew pełną uzyskuje się technikami małoinwazyjnymi, ale ekspresja genów może być gorszej jakości w porównaniu z fibroblastami.

Pierwsza część badania jest wykonywana w warunkach diagnostycznych w nierozwiązanych przypadkach bezmózgowia. Fibroblasty zostaną uzyskane przez biopsję skóry (punch). Dane seq RNA zostaną wyodrębnione z fibroblastów i krwi. Te dane seq RNA zostaną przeanalizowane w poszukiwaniu nowych wariantów patogennych. Gdy nowe warianty patogenne zostaną zidentyfikowane w danych sekwencji RNA, istniejące dane WES zostaną ponownie przeanalizowane. W razie potrzeby wykonane zostaną kolejne WGS. Po uzyskaniu diagnozy genetycznej dane RNA seq i WES/WGS zostaną przeniesione do części badawczej badania.

Druga część badania odbywa się w warunkach badawczych. Pacjenci z lissencephaly z rozpoznaniem genetycznym zostaną poproszeni o pobranie biopsji skóry i . Dane seq RNA zostaną wyodrębnione z fibroblastów i krwi, tak jak w ścieżce diagnostycznej. W danych sekwencji RNA zaobserwowane zostaną dwie pozycje. Po pierwsze, czy dane seq RNA wyekstrahowane z fibroblastów mają główną przewagę nad danymi seq RNA wyekstrahowanymi z krwi pod względem wykrywania wariantów? Po drugie, czy można zidentyfikować wzorce RNA w typowych szlakach dotkniętych chorobą?