Combinando dados de exoma e transcriptoma para desvendar a base genética das lissencefalias

Como mencionado anteriormente, as lissencefalias têm uma forte base monogenética em contraste com outras malformações cerebrais. Aproximadamente 80% das lissencefalias podem ser geneticamente diagnosticadas por WES ou WGS padrão.1 Nos 20% restantes dos casos não resolvidos, o sequenciamento quantitativo de RNA pode fazer uma diferença considerável. Ao identificar padrões de expressão de RNA em lisencefalias, tentaremos fornecer um diagnóstico genético aos casos de lisencefalia não resolvidos. Um diagnóstico genético é importante para prever problemas associados, acompanhamento, prognóstico e, em alguns casos, planejamento familiar (ex. testes genéticos pré-implantação). Este estudo também investigará o rendimento diagnóstico adicional do sequenciamento de RNA em lissencefalias e, por extensão, no espectro de MCD. E, se indicado, a viabilidade de implementar o sequenciamento de RNA na investigação padrão de diagnóstico.

Alta eficiência na identificação de novas variantes patogênicas e anotação de novos genes pode ser esperada devido à forte base monogenética. Estas novas variantes e anotação de genes são indispensáveis ​​para uma melhor compreensão da origem e fisiopatologia do espectro da lisencefalia e migração neuronal.

O impacto funcional de genes recém-descobertos pode ser mais investigado pelo método inovador CRISPR-Cas9. Essa técnica de edição de genes permite que os pesquisadores criem genes knock-out ou mesmo knock-in, como uma oportunidade para investigar novos genes anotados e suas consequências funcionais. Embora esteja fora do escopo deste estudo, é um item interessante para futuros projetos de pesquisa conjunta, dentro do nosso grupo de pesquisa ou em colaboração com outros. Durante este estudo, também os casos de lisencefalia diagnosticados geneticamente serão submetidos a sequenciamento de RNA. A classificação atual das lissencefalias é baseada em variantes patogênicas e vias biológicas. Alterações no padrão de expressão do RNA poderiam lançar uma nova luz sobre essa classificação.

Este estudo também avaliará quais tecidos de amostragem são mais adequados para extração e sequenciamento de RNA. As considerações a fazer incluem a qualidade direcionada do RNA extraído e as diferenças na expressão gênica específica do tecido. As trocas bucais, embora não invasivas, não são adequadas para extração de RNA por causa da flora oral natural com vários vírus e bactérias (material genético exógeno). O RNA derivado de fibroblastos é considerado de boa qualidade, mas uma biópsia de pele é necessária e considerada relativamente invasiva. O sangue total é obtido por técnicas minimamente invasivas, mas a expressão gênica pode ser de qualidade inferior em comparação com os fibroblastos.

A primeira parte do estudo é realizada em um ambiente de diagnóstico em casos não resolvidos de lisencefalia. Os fibroblastos serão obtidos por biópsia de pele (punch). Dados de sequência de RNA serão extraídos de fibroblastos e sangue. Esses dados de sequência de RNA serão analisados ​​em busca de novas variantes patogênicas. Quando novas variantes patogênicas são identificadas nos dados de sequência de RNA, os dados WES existentes serão reanalisados. Se necessário, o WGS subseqüente será executado. Quando um diagnóstico genético é obtido, os dados de RNA seq e WES/WGS serão transferidos para a parte de pesquisa do estudo.

Uma segunda parte do estudo é realizada em um ambiente de pesquisa. Pacientes com lisencefalia com diagnóstico genético serão propostos para doar uma biópsia de pele e . Os dados de sequência de RNA serão extraídos de fibroblastos e sangue como na faixa de diagnóstico. Nos dados de sequência de RNA, dois itens serão observados. Em primeiro lugar, os dados de sequência de RNA extraídos de fibroblastos têm uma grande vantagem sobre os dados de sequência de RNA extraídos do sangue em termos de detecção de variantes? Em segundo lugar, os padrões de RNA podem ser identificados em vias afetadas comuns?