Combinazione dei dati dell'esoma e del trascrittoma per svelare la base genetica delle lissencefalie

Come accennato in precedenza, le lissencefalie hanno una forte base monogenetica in contrasto con altre malformazioni cerebrali. Circa l'80% per cento delle lissencefalie può essere diagnosticato geneticamente mediante WES o WGS standard.1 Nel restante 20% per cento dei casi irrisolti, il sequenziamento quantitativo dell'RNA potrebbe fare una differenza considerevole. Identificando i pattern di espressione dell'RNA nelle lissencefalie cercheremo di fornire una diagnosi genetica ai casi irrisolti di lissencefalia. Una diagnosi genetica è importante in termini di previsione dei problemi associati, follow-up, prognosi e in alcuni casi pianificazione familiare (ad es. test genetici preimpianto). Questo studio esaminerà anche la resa diagnostica aggiuntiva del sequenziamento dell'RNA nelle lissencefalie e, per estensione, nello spettro MCD. E, se indicato, la fattibilità dell'implementazione del sequenziamento dell'RNA nel work-up diagnostico standard.

Ci si può aspettare un'elevata efficienza nell'identificare nuove varianti patogene e nuove annotazioni geniche a causa della forte base monogenetica. Queste nuove varianti e annotazioni geniche sono indispensabili per comprendere meglio l'origine e la fisiopatologia dello spettro della lissencefalia e della migrazione neuronale.

L'impatto funzionale dei geni appena scoperti può essere ulteriormente studiato con l'innovativo metodo CRISPR-Cas9. Questa tecnica di modifica genetica consente ai ricercatori di creare geni knock-out o addirittura knock-in, come opportunità per studiare nuovi geni annotati e le loro conseguenze funzionali. Sebbene esuli dallo scopo di questo studio, è un elemento interessante per futuri progetti di ricerca congiunti, all'interno del nostro gruppo di ricerca o in collaborazione con altri. Durante questo studio, anche i casi di lissencefalia diagnosticati geneticamente saranno sottoposti a sequenziamento dell'RNA. L'attuale classificazione delle lissencefalie si basa su varianti patogene e percorsi biologici. Le alterazioni nel modello di espressione dell'RNA potrebbero gettare nuova luce su questa classificazione.

Questo studio valuterà anche quali tessuti di campionamento sono più adatti per l'estrazione e il sequenziamento dell'RNA. Le considerazioni da fare includono la qualità mirata dell'RNA estratto e le differenze nell'espressione genica tessuto-specifica. Gli scambi di bocca, sebbene non invasivi, non sono adatti per l'estrazione dell'RNA a causa della flora orale naturale con più virus e batteri (materiale genetico esogeno). L'RNA derivato dai fibroblasti è considerato di buona qualità, ma è necessaria una biopsia cutanea ed è considerata relativamente invasiva. Il sangue intero è ottenuto con tecniche minimamente invasive, ma l'espressione genica può essere di qualità inferiore rispetto ai fibroblasti.

La prima parte dello studio viene eseguita in ambito diagnostico in casi di lissencefalia irrisolti. I fibroblasti saranno ottenuti mediante biopsia cutanea (punch). I dati di RNA seq verranno estratti dai fibroblasti e dal sangue. Questi dati di RNA seq saranno analizzati alla ricerca di nuove varianti patogene. Quando vengono identificate nuove varianti patogene nei dati RNA seq, i dati WES esistenti verranno rianalizzati. Se necessario, verrà eseguito il successivo WGS. Quando si ottiene una diagnosi genetica, i dati di RNA seq e WES/WGS verranno trasferiti alla parte di ricerca dello studio.

Una seconda parte dello studio viene eseguita in un contesto di ricerca. Ai pazienti con lissencefalia con diagnosi genetica verrà proposto di donare una biopsia cutanea e . I dati di RNA seq verranno estratti dai fibroblasti e dal sangue come nella traccia diagnostica. Nei dati RNA seq si osserveranno due elementi. In primo luogo, i dati di RNA seq estratti dai fibroblasti rappresentano un grande vantaggio rispetto ai dati di RNA seq estratti dal sangue in termini di rilevamento delle varianti? In secondo luogo, i modelli di RNA possono essere identificati nei percorsi comuni interessati?