Infusão de Leptina e Resposta Vasomotora Endotelial (LIVARM)

Introdução O IMC elevado e, particularmente, o índice de massa gorda estão associados ao aumento do risco de doença arterial coronariana e outras condições cardiovasculares, mas os mecanismos subjacentes não são bem compreendidos. A disfunção endotelial precede a aterosclerose e representa um importante elo entre obesidade e eventos cardiovasculares.

O tecido adiposo produz citocinas e hormônios (adipocinas), que, em excesso, podem promover doenças cardiovasculares por efeitos pró-inflamatórios, pró-trombóticos, dislipidêmicos e ateroscleróticos.

A leptina é uma adipocina com efeitos pleiotrópicos e os níveis circulantes de leptina estão positivamente associados à quantidade de gordura corporal. Níveis elevados de leptina plasmática (hiperleptinemia) estão associados ao desenvolvimento de aterosclerose, hipertensão e doença arterial coronariana (DAC). A leptina ativa receptores específicos de leptina expressos, entre outros tecidos, em células vasculares, sugerindo que a leptina pode participar do desenvolvimento de disfunção endotelial e aterosclerose.

No entanto, o efeito líquido da leptina na função vasomotora permanece obscuro, já que tanto a vasodilatação quanto a vasoconstrição foram relatadas. A leptina induz a liberação de óxido nítrico (NO) in vitro e provoca vasodilatação dependente do endotélio em camundongos pela indução da expressão endotelial da NO sintase. Além disso, estudos em humanos demonstraram que a infusão de leptina exerce vasodilatação. Em contraste, outros mostraram vasoconstrição induzida pela leptina in vitro e vasodilatação prejudicada em cães. Diferentes mecanismos têm sido propostos causando aumento da resistência vascular periférica, como inflamação vascular, aumento da atividade do sistema nervoso simpático (SNS), aumento da produção de endotelina-1 (ET-1) e diminuição da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO).

A hiperleptinemia tem sido associada a estados de fibrinólise alterada, comum em diabetes, doenças cardiovasculares e obesidade. No entanto, ainda não está claro se a leptina influencia diretamente a função fibrinolítica endógena.

O objetivo desses estudos foi avaliar o papel da leptina na função endotelial em humanos. Para tanto, as funções vasomotora e fibrinolítica foram avaliadas em homens saudáveis ​​durante um estado de hiperleptinemia induzida farmacologicamente. Em um estudo paralelo, a função endotelial foi avaliada em pacientes com DAC estabelecida e relacionada aos níveis plasmáticos de leptina.

Material e métodos

Indivíduos Dezessete voluntários saudáveis, não fumantes, do sexo masculino, que não tomavam nenhuma medicação regular, foram recrutados em Umeå, Suécia (três homens participaram do protocolo 1 e do protocolo 2). Oitenta e três pacientes com DAC estabelecida foram recrutados do ambulatório de cardiologia do Royal Infirmary, Edimburgo, Escócia, e as características dessa coorte foram relatadas anteriormente. Esses pacientes apresentavam angina estável e documentação angiográfica prévia de estenose luminal ≥50% de pelo menos um grande vaso coronário epicárdico. O consentimento informado por escrito foi obtido de cada indivíduo e os estudos foram realizados de acordo com a Declaração de Helsinque.

Pletismografia de oclusão venosa Os indivíduos se abstiveram de álcool por 24 horas e de alimentos, tabaco e bebidas contendo cafeína por pelo menos 4 horas antes de cada visita do estudo. Todos os estudos foram realizados em uma sala silenciosa com temperatura controlada mantida a 22-25 graus Celsius (ºC). Uma cânula venosa 17-G foi inserida na veia antecubital de cada braço e a artéria braquial do braço não dominante foi canulada com uma agulha 27-G (Cooper's Needle Works Ltd, Reino Unido). O fluxo sanguíneo bilateral do antebraço foi medido por pletismografia de oclusão venosa usando extensômetros de mercúrio em silastic. A pressão arterial e a frequência cardíaca foram medidas usando um esfigmomanômetro não invasivo semiautomático. Para evitar efeitos vasomotores agudos, todos os medicamentos foram suspensos na manhã de cada estudo.

Design de estudo

Protocolo 1 Em dez voluntários saudáveis ​​do sexo masculino, leptina humana recombinante (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, EUA) foi infundida intra-arterialmente em doses crescentes de 80, 800 e 8.000 ng/min (6 minutos cada). As concentrações de freqüência cardíaca, pressão arterial, fluxo sanguíneo do antebraço, leptina, antígeno do ativador do plasminogênio tecidual (tPA) e inibidor do ativador do plasminogênio tipo 1 (PAI-1) foram determinadas no final de cada dose.

Protocolo 2 Em um estudo cruzado randomizado duplo-cego, dez voluntários saudáveis ​​do sexo masculino receberam infusões intra-arteriais de leptina (800 ng/min) ou solução salina em duas ocasiões separadas com pelo menos 2 semanas entre as visitas. O fluxo sanguíneo do antebraço foi medido nos braços infundidos e não infundidos na linha de base e em intervalos regulares durante a infusão de leptina/solução salina de uma hora. Posteriormente, quatro vasodilatadores foram infundidos concomitantemente com infusões intra-arteriais de leptina/soro fisiológico; bradicinina (vasodilatador dependente do endotélio que libera tPA) a 100, 300 e 1.000 pmol/min (Clinalfa Ltda, Suíça), acetilcolina (vasodilatador dependente do endotélio que não libera tPA) a 5, 10 e 20 µg/min (Clinalfa Ltda , Suíça), nitroprussiato de sódio (vasodilatador independente do endotélio) a 2, 4 e 8 µg/min (laboratórios David Bull, Reino Unido) e verapamil (vasodilatador independente do endotélio) a 10, 30, 100 µg/min (Abbott UK Ltd) por 6 minutos em cada concentração. Vasodilatadores foram infundidos em uma ordem aleatória com um período de lavagem salina de 15 minutos entre cada droga. O verapamil foi sempre administrado ao final devido aos seus efeitos vasomotores duradouros.

O sangue venoso foi obtido dos braços infundidos e não infundidos no início, antes e durante a infusão de bradicinina, aos 60 minutos e ao final do protocolo do estudo.

Protocolo 3 Em pacientes com DAC (n=83), o fluxo sanguíneo bilateral do antebraço foi medido antes e durante infusões intra-arteriais de substância P (vasodilatador dependente do endotélio que libera tPA) a 2, 4 e 8 pmol/min (Clinalfa Ltd, Suíça), acetilcolina a 5, 10 e 20 µg/min (como acima) e nitroprussiato de sódio a 2, 4 e 8 µg/min (como acima) por 6 minutos em cada concentração. A bradicinina não foi administrada porque muitos indivíduos estavam sendo tratados com inibição da enzima conversora de angiotensina e isso potencializa acentuadamente seus efeitos vasodilatadores e fibrinolíticos. Os vasodilatadores foram administrados em ordem aleatória com um período de lavagem salina de 15 minutos entre cada droga. Amostras de sangue venoso foram obtidas antes e durante a infusão intra-arterial da substância P para medir os marcadores fibrinolíticos.

Amostragem e ensaios venosos Amostras de sangue venoso em jejum foram coletadas em tubos contendo citrato tamponado acidificado ou citrato trissódico. As amostras foram coletadas imediatamente em gelo e centrifugadas a 2.000 g por 30 min. Plasma e soro sem plaquetas foram armazenados a -80°C antes do ensaio. O peptídeo natriurético cerebral (BNP), as concentrações de colesterol e glicose foram determinadas de acordo com a rotina clínica e a proteína C-reativa de alta sensibilidade (hsCRP) com um ensaio altamente sensível usando imunonefelometria aprimorada por partículas (nefelômetro Behring BN II). As concentrações plasmáticas de leptina foram medidas usando um radioimunoensaio de duplo anticorpo (Millipore, Billerica, Massachusetts, EUA). Os coeficientes de variação intra e inter-ensaios foram inferiores a 5% tanto nas concentrações baixas (2-4 ng/mL) quanto nas altas (10-15 ng/mL) de leptina. As concentrações de antígenos de tPA e PAI-1 no plasma foram determinadas usando ensaios imunoenzimáticos (Coaliza®, Chromogenix Ltd) e a atividade de tPA no plasma usando um método fotométrico (Coatest tPA, Chromogenix Ltd). Os coeficientes de variação para ensaios fibrinolíticos foram de 5,9% e 12% para o antígeno tPA e atividade, respectivamente, e 6,2% para o antígeno PAI-1. A liberação líquida estimada de tPA (antígeno e atividade) foi calculada conforme descrito anteriormente após cada dose de bradicinina ou substância P, como o produto do fluxo de plasma infundido no antebraço e a diferença nos níveis plasmáticos entre os antebraços infundidos e não infundidos.