Infuzja leptyny i odpowiedź naczynioruchowa śródbłonka (LIVARM)

Wprowadzenie Wysokie BMI, a zwłaszcza wskaźnik masy tkanki tłuszczowej, wiążą się ze zwiększonym ryzykiem choroby wieńcowej i innych chorób sercowo-naczyniowych, ale leżące u ich podstaw mechanizmy nie są dobrze poznane. Dysfunkcja śródbłonka poprzedza miażdżycę tętnic i stanowi ważny związek między otyłością a zdarzeniami sercowo-naczyniowymi.

Tkanka tłuszczowa wytwarza cytokiny i hormony (adipokiny), które w nadmiarze mogą sprzyjać chorobom układu krążenia poprzez działanie prozapalne, prozakrzepowe, dyslipidemiczne i miażdżycowe.

Leptyna jest adipokiną o działaniu plejotropowym, a poziom krążącej leptyny jest dodatnio skorelowany z ilością tkanki tłuszczowej. Wysoki poziom leptyny w osoczu krwi (hiperleptynemia) wiąże się z rozwojem miażdżycy, nadciśnienia i choroby wieńcowej (CAD). Leptyna aktywuje specyficzne receptory leptyny, których ekspresja występuje m.in. w komórkach naczyniowych, co sugeruje, że leptyna może uczestniczyć w rozwoju dysfunkcji śródbłonka i miażdżycy.

Jednak wpływ netto leptyny na funkcje naczynioruchowe pozostaje niejasny, ponieważ zgłaszano zarówno rozszerzenie naczyń, jak i skurcz naczyń. Leptyna indukuje uwalnianie tlenku azotu (NO) in vitro i wywołuje zależne od śródbłonka rozszerzenie naczyń u myszy poprzez indukcję śródbłonkowej ekspresji syntazy NO. Ponadto badania na ludziach wykazały, że wlew leptyny powoduje rozszerzenie naczyń. W przeciwieństwie do innych, in vitro wykazano zwężenie naczyń wywołane przez leptynę i upośledzone rozszerzenie naczyń u psów. Zaproponowano różne mechanizmy powodujące zwiększony obwodowy opór naczyniowy, takie jak zapalenie naczyń, zwiększona aktywność współczulnego układu nerwowego (SNS), zwiększona produkcja endoteliny-1 (ET-1) i zmniejszona biodostępność tlenku azotu (NO).

Hiperleptynemia została powiązana ze stanami zmienionej fibrynolizy, co jest powszechne w cukrzycy, chorobach sercowo-naczyniowych i otyłości. Jednak to, czy leptyna bezpośrednio wpływa na endogenną funkcję fibrynolityczną, pozostaje niejasne.

Celem tych badań była ocena roli leptyny w funkcjonowaniu śródbłonka u ludzi. W tym celu oceniano funkcje naczynioruchowe i fibrynolityczne u zdrowych mężczyzn w stanie hiperleptynemii indukowanej farmakologicznie. W równoległym badaniu oceniano funkcję śródbłonka u pacjentów z rozpoznaną chorobą wieńcową w odniesieniu do stężenia leptyny w osoczu.

Materiał i metody

Badani W Umeå w Szwecji zwerbowano siedemnastu zdrowych, niepalących ochotników płci męskiej, którzy nie przyjmowali żadnych regularnych leków (trzech mężczyzn uczestniczyło zarówno w protokole 1, jak iw protokole 2). Osiemdziesięciu trzech pacjentów z ustaloną chorobą wieńcową rekrutowano z ambulatorium kardiologicznego w Royal Infirmary w Edynburgu w Szkocji, a charakterystyka tej kohorty została opisana wcześniej. Pacjenci ci mieli stabilną dławicę piersiową i wcześniej angiograficzną udokumentowano zwężenie światła co najmniej jednego dużego nasierdziowego naczynia wieńcowego o ≥50%. Od każdego podmiotu uzyskano pisemną świadomą zgodę, a badania przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską.

Pletyzmografia okluzji żylnej Badani powstrzymywali się od alkoholu przez 24 godziny oraz od jedzenia, tytoniu i napojów zawierających kofeinę przez co najmniej 4 godziny przed każdą wizytą badawczą. Wszystkie badania przeprowadzono w cichym pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą utrzymywaną w temperaturze 22-25 stopni Celsjusza (ºC). Kaniulę żylną 17-G wprowadzono do żyły przedłokciowej każdego ramienia, a tętnicę ramienną ramienia niedominującego wprowadzono igłą 27-G (Cooper's Needle Works Ltd, Wielka Brytania). Obustronny przepływ krwi w przedramieniu mierzono za pomocą pletyzmografii żylnej za pomocą tensometrów rtęci w silastyce. Ciśnienie krwi i tętno mierzono za pomocą półautomatycznego nieinwazyjnego sfigmomanometru. Aby uniknąć ostrych efektów naczynioruchowych, wszystkie leki zostały wstrzymane rano każdego badania.

Projekt badania

Protokół 1 Dziesięciu zdrowym ochotnikom płci męskiej podano we wlewie dotętniczym rekombinowaną ludzką leptynę (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, USA) w rosnących dawkach 80, 800 i 8000 ng/min (każda po 6 minut). Częstość akcji serca, ciśnienie krwi, przepływ krwi w przedramieniu, stężenie leptyny, antygenu tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) i antygenu inhibitora aktywatora plazminogenu typu 1 (PAI-1) oznaczano na końcu każdej dawki.

Protokół 2 W randomizowanym, krzyżowym badaniu z podwójnie ślepą próbą, dziesięciu zdrowych ochotników płci męskiej otrzymało dotętnicze wlewy leptyny (800 ng/min) lub soli fizjologicznej przy dwóch różnych okazjach, z co najmniej 2-tygodniowymi przerwami między wizytami. Przepływ krwi w przedramieniu mierzono w ramionach poddanych infuzji i bez infuzji na początku badania oraz w regularnych odstępach czasu podczas jednogodzinnej infuzji leptyny/soli fizjologicznej. Następnie cztery środki rozszerzające naczynia krwionośne podawano jednocześnie z dotętniczymi wlewami leptyny/soli fizjologicznej; bradykinina (zależny od śródbłonka środek rozszerzający naczynia krwionośne, który uwalnia tPA) w dawce 100, 300 i 1000 pmol/min (Clinalfa Ltd, Szwajcaria), acetylocholina (zależny od śródbłonka środek rozszerzający naczynia krwionośne, który nie uwalnia tPA) w dawce 5, 10 i 20 µg/min (Clinalfa Ltd , Szwajcaria), nitroprusydek sodu (środek rozszerzający naczynia krwionośny niezależny od śródbłonka) w dawce 2, 4 i 8 µg/min (David Bull laboratoriów, Wielka Brytania) oraz werapamil (środek rozszerzający naczynia krwionośny niezależny od śródbłonka) w dawce 10, 30, 100 µg/min (Abbott UK Ltd) przez 6 minut w każdym stężeniu. Środki rozszerzające naczynia krwionośne podawano w losowej kolejności z 15-minutowym okresem wypłukiwania soli fizjologicznej pomiędzy każdym lekiem. Werapamil był zawsze podawany na końcu ze względu na jego długotrwałe działanie naczynioruchowe.

Krew żylną uzyskano z ramion, w których podano infuzję i nie podano infuzji, na początku badania, przed i podczas infuzji bradykininy, po 60 minutach i na końcu protokołu badania.

Protokół 3 U pacjentów z CAD (n=83) mierzono obustronny przepływ krwi w przedramieniu przed i podczas dotętniczych wlewów substancji P (zależny od śródbłonka środek rozszerzający naczynia krwionośne, który uwalnia tPA) przy 2, 4 i 8 pmol/min (Clinalfa Ltd, Szwajcaria), acetylocholina przy 5, 10 i 20 µg/min (jak powyżej) oraz nitroprusydek sodu przy 2, 4 i 8 µg/min (jak powyżej) przez 6 minut w każdym stężeniu. Bradykininy nie podawano, ponieważ wielu pacjentów było leczonych za pomocą hamowania konwertazy angiotensyny, co znacznie nasila jej działanie rozszerzające naczynia krwionośne i działanie fibrynolityczne. Leki rozszerzające naczynia krwionośne podawano w losowej kolejności z 15-minutowym okresem wypłukiwania soli fizjologicznej pomiędzy każdym lekiem. Próbki krwi żylnej pobierano przed i podczas wlewu dotętniczego substancji P w celu pomiaru markerów fibrynolitycznych.

Pobieranie próbek żylnych i testy Próbki krwi żylnej na czczo pobierano do probówek zawierających zakwaszony, buforowany cytrynian lub cytrynian trisodowy. Próbki natychmiast pobrano na lód i wirowano przy 2000 g przez 30 minut. Bezpłytkowe osocze i surowicę przechowywano przed oznaczeniem w temperaturze -80°C. Stężenia mózgowego peptydu natriuretycznego (BNP), cholesterolu i glukozy oznaczano zgodnie z rutyną kliniczną, a białko C-reaktywne (hsCRP) o wysokiej czułości oznaczano za pomocą wysoce czułego testu z wykorzystaniem immunonefelometrii ze wzmocnionymi cząsteczkami (nefelometr Behring BN II). Stężenia leptyny w osoczu mierzono za pomocą testu radioimmunologicznego z podwójnym przeciwciałem (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA). Współczynniki zmienności wewnątrz i między testami wynosiły mniej niż 5% zarówno przy niskim (2-4 ng/ml), jak i wysokim (10-15 ng/ml) stężeniu leptyny. Stężenia antygenu tPA i PAI-1 w osoczu określono za pomocą testów immunoenzymatycznych (Coaliza®, Chromogenix Ltd), a aktywność tPA w osoczu za pomocą metody fotometrycznej (Coatest tPA, Chromogenix Ltd). Współczynniki zmienności dla testów fibrynolitycznych wynosiły odpowiednio 5,9% i 12% dla antygenu i aktywności tPA oraz 6,2% dla antygenu PAI-1. Szacunkowe uwalnianie netto tPA (antygen i aktywność) obliczono jak opisano poprzednio po każdej dawce bradykininy lub substancji P, jako iloczyn przepływu osocza w przedramieniu po infuzji i różnicy poziomów w osoczu między przedramionami po infuzji i bez infuzji.