Infusione di leptina e risposta vasomotoria endoteliale (LIVARM)

Introduzione Un BMI elevato e in particolare un indice di massa grassa sono associati ad un aumentato rischio di malattia coronarica e altre condizioni cardiovascolari, ma i meccanismi sottostanti non sono ben compresi. La disfunzione endoteliale precede l'aterosclerosi e rappresenta un importante legame tra obesità ed eventi cardiovascolari.

Il tessuto adiposo produce citochine e ormoni (adipochine) che, in eccesso, possono favorire malattie cardiovascolari con effetti proinfiammatori, protrombotici, dislipidemici e aterosclerotici.

La leptina è una adipochina con effetti pleiotropici e i livelli circolanti di leptina sono positivamente associati alla quantità di grasso corporeo. Elevati livelli plasmatici di leptina (iperleptinemia) si associano allo sviluppo di aterosclerosi, ipertensione e malattia coronarica (CAD). La leptina attiva specifici recettori della leptina espressi, tra gli altri tessuti, nelle cellule vascolari, suggerendo che la leptina può partecipare allo sviluppo della disfunzione endoteliale e dell'aterosclerosi.

Tuttavia, l'effetto netto della leptina sulla funzione vasomotoria rimane poco chiaro, poiché sono state riportate sia vasodilatazione che vasocostrizione. La leptina induce il rilascio di ossido nitrico (NO) in vitro e provoca vasodilatazione endotelio-dipendente nei topi inducendo l'espressione endoteliale di NO sintasi. Inoltre, studi sull'uomo hanno dimostrato che l'infusione di leptina esercita vasodilatazione. Al contrario, altri hanno mostrato vasocostrizione indotta dalla leptina in vitro e ridotta vasodilatazione nei cani. Sono stati proposti diversi meccanismi che causano un aumento della resistenza vascolare periferica, come l'infiammazione vascolare, l'aumento dell'attività del sistema nervoso simpatico (SNS), l'aumento della produzione di endotelina-1 (ET-1) e la diminuzione della biodisponibilità dell'ossido nitrico (NO).

L'iperleptinemia è stata associata a stati di fibrinolisi alterata, che è comune nel diabete, nelle malattie cardiovascolari e nell'obesità. Tuttavia, non è chiaro se la leptina influenzi direttamente la funzione fibrinolitica endogena.

Lo scopo di questi studi era valutare il ruolo della leptina sulla funzione endoteliale nell'uomo. A tale scopo sono state valutate le funzioni vasomotorie e fibrinolitiche in uomini sani durante uno stato di iperleptinemia farmacologicamente indotta. In uno studio parallelo, la funzione endoteliale è stata valutata in pazienti con CAD accertata e correlata ai livelli plasmatici di leptina.

Materiale e metodi

Soggetti Diciassette volontari maschi sani non fumatori che non assumevano alcun farmaco regolare sono stati reclutati a Umeå, in Svezia (tre maschi hanno partecipato sia al protocollo 1 che al protocollo 2). Ottantatré pazienti con CAD accertata sono stati reclutati dalla clinica ambulatoriale di cardiologia presso la Royal Infirmary, Edimburgo, Scozia, e le caratteristiche di questa coorte sono state riportate in precedenza. Questi pazienti presentavano angina stabile e avevano una precedente documentazione angiografica di stenosi luminale ≥50% di almeno un grande vaso coronarico epicardico. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun soggetto e gli studi sono stati condotti in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.

Pletismografia dell'occlusione venosa I soggetti si sono astenuti dall'alcol per 24 ore e da cibo, tabacco e bevande contenenti caffeina per almeno 4 ore prima di ogni visita di studio. Tutti gli studi sono stati condotti in una stanza silenziosa a temperatura controllata mantenuta a 22-25 gradi Celsius (ºC). Una cannula venosa da 17 G è stata inserita nella vena antecubitale di ciascun braccio e l'arteria brachiale del braccio non dominante è stata incannulata con un ago da 27 G (Cooper's Needle Works Ltd, Regno Unito). Il flusso sanguigno bilaterale dell'avambraccio è stato misurato mediante pletismografia dell'occlusione venosa utilizzando estensimetri al mercurio in silastico. La pressione sanguigna e la frequenza cardiaca sono state misurate utilizzando uno sfigmomanometro semiautomatico non invasivo. Per evitare effetti vasomotori acuti, tutti i farmaci sono stati sospesi la mattina di ogni studio.

Progettazione dello studio

Protocollo 1 In dieci volontari maschi sani, la leptina umana ricombinante (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, USA) è stata infusa per via intra-arteriosa a dosi crescenti di 80, 800 e 8.000 ng/min (6 minuti ciascuna). La frequenza cardiaca, la pressione sanguigna, il flusso sanguigno dell'avambraccio, la leptina, l'antigene dell'attivatore del plasminogeno tissutale (tPA) e le concentrazioni dell'antigene dell'inibitore dell'attivatore del plasminogeno di tipo 1 (PAI-1) sono state determinate alla fine di ciascuna dose.

Protocollo 2 In uno studio incrociato randomizzato in doppio cieco, dieci volontari maschi sani hanno ricevuto infusioni intra-arteriose di leptina (800 ng/min) o soluzione fisiologica in due occasioni separate con almeno 2 settimane tra le visite. Il flusso sanguigno dell'avambraccio è stato misurato nei bracci infusi e non infusi al basale ea intervalli regolari durante l'infusione di leptina/soluzione salina di un'ora. Successivamente quattro vasodilatatori sono stati infusi in concomitanza con infusioni intra-arteriose di leptina/soluzione salina; bradichinina (vasodilatatore endotelio-dipendente che rilascia tPA) a 100, 300 e 1.000 pmol/min (Clinalfa Ltd, Svizzera), acetilcolina (vasodilatatore endotelio-dipendente che non rilascia tPA) a 5, 10 e 20 µg/min (Clinalfa Ltd , Svizzera), nitroprussiato di sodio (vasodilatatore endotelio-indipendente) a 2, 4 e 8 µg/min (laboratori David Bull, Regno Unito) e verapamil (vasodilatatore endotelio-indipendente) a 10, 30, 100 µg/min (Abbott UK Ltd) per 6 minuti ad ogni concentrazione. I vasodilatatori sono stati infusi in ordine randomizzato con un periodo di washout salino di 15 minuti tra ogni farmaco. Il verapamil veniva sempre somministrato alla fine a causa dei suoi effetti vasomotori di lunga durata.

Il sangue venoso è stato ottenuto dai bracci infusi e non infusi al basale, prima e durante l'infusione di bradichinina, a 60 minuti e alla fine del protocollo di studio.

Protocollo 3 Nei pazienti con CAD (n=83), il flusso sanguigno bilaterale dell'avambraccio è stato misurato prima e durante le infusioni intra-arteriose della sostanza P (vasodilatatore endotelio-dipendente che rilascia tPA) a 2, 4 e 8 pmol/min (Clinalfa Ltd, Svizzera), acetilcolina a 5, 10 e 20 µg/min (come sopra) e nitroprussiato di sodio a 2, 4 e 8 µg/min (come sopra) per 6 minuti a ciascuna concentrazione. La bradichinina non è stata somministrata perché molti soggetti erano in trattamento con l'inibizione dell'enzima di conversione dell'angiotensina e ciò potenzia notevolmente i suoi effetti vasodilatatori e fibrinolitici. I vasodilatatori sono stati somministrati in ordine casuale con un periodo di sospensione della soluzione salina di 15 minuti tra ogni farmaco. Sono stati prelevati campioni di sangue venoso prima e durante l'infusione intra-arteriosa della sostanza P per misurare i marcatori fibrinolitici.

Prelievo venoso e analisi I campioni di sangue venoso a digiuno sono stati prelevati in provette contenenti citrato tamponato acidificato o citrato trisodico. I campioni sono stati raccolti immediatamente su ghiaccio e centrifugati a 2.000 g per 30 min. Il plasma e il siero privi di piastrine sono stati conservati a -80°C prima del dosaggio. Le concentrazioni di peptide natriuretico cerebrale (BNP), colesterolo e glucosio sono state determinate secondo la routine clinica e la proteina C-reattiva ad alta sensibilità (hsCRP) con un test altamente sensibile utilizzando l'immunonefelometria potenziata da particelle (nefelometro Behring BN II). Le concentrazioni plasmatiche di leptina sono state misurate utilizzando un dosaggio radioimmunologico a doppio anticorpo (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA). I coefficienti di variazione intra e inter-dosaggio erano inferiori al 5% a concentrazioni di leptina sia basse (2-4 ng/mL) che alte (10-15 ng/mL). Le concentrazioni plasmatiche di tPA e antigene PAI-1 sono state determinate utilizzando saggi di immunoassorbimento enzimatico (Coaliza®, Chromogenix Ltd) e l'attività plasmatica di tPA utilizzando un metodo fotometrico (Coatest tPA, Chromogenix Ltd). I coefficienti di variazione per i dosaggi fibrinolitici erano rispettivamente del 5,9% e del 12% per l'antigene e l'attività tPA e del 6,2% per l'antigene PAI-1. Il rilascio netto stimato di tPA (antigene e attività) è stato calcolato come precedentemente descritto dopo ciascuna dose di bradichinina o sostanza P, come prodotto del flusso plasmatico dell'avambraccio infuso e la differenza dei livelli plasmatici tra gli avambracci infusi e quelli non infusi.