Infuze leptinu a endoteliální vazomotorická odpověď (LIVARM)

Úvod Vysoké BMI a zejména index tukové hmoty jsou spojeny se zvýšeným rizikem onemocnění koronárních tepen a dalších kardiovaskulárních onemocnění, ale základní mechanismy nejsou dobře pochopeny. Endoteliální dysfunkce předchází ateroskleróze a představuje důležité spojení mezi obezitou a kardiovaskulárními příhodami.

Tuková tkáň produkuje cytokiny a hormony (adipokiny), které v přebytku mohou podporovat kardiovaskulární onemocnění prozánětlivými, protrombotickými, dyslipidemickými a aterosklerotickými účinky.

Leptin je adipokin s pleiotropními účinky a hladiny cirkulujícího leptinu jsou pozitivně spojeny s množstvím tělesného tuku. Vysoké hladiny leptinu v plazmě (hyperleptinémie) jsou spojeny s rozvojem aterosklerózy, hypertenze a onemocnění koronárních tepen (CAD). Leptin aktivuje specifické leptinové receptory exprimované, kromě jiných tkání, ve vaskulárních buňkách, což naznačuje, že leptin se může podílet na rozvoji endoteliální dysfunkce a aterosklerózy.

Čistý účinek leptinu na vazomotorické funkce však zůstává nejasný, protože byla hlášena jak vazodilatace, tak vazokonstrikce. Leptin indukuje uvolňování oxidu dusnatého (NO) in vitro a vyvolává vazodilataci závislou na endotelu u myší indukcí endoteliální exprese NO syntázy. Kromě toho studie na lidech ukázaly, že infuze leptinu vyvolává vazodilataci. Naproti tomu jiní prokázali leptinem indukovanou vazokonstrikci in vitro a zhoršenou vazodilataci u psů. Byly navrženy různé mechanismy způsobující zvýšenou periferní vaskulární rezistenci, jako je vaskulární zánět, zvýšená aktivita sympatického nervového systému (SNS), zvýšená produkce endotelinu-1 (ET-1) a snížená biologická dostupnost oxidu dusnatého (NO).

Hyperleptinémie je spojována se stavy změněné fibrinolýzy, která je běžná u diabetu, kardiovaskulárních onemocnění a obezity. Není však jasné, zda leptin přímo ovlivňuje endogenní fibrinolytickou funkci.

Cílem těchto studií bylo zhodnotit roli leptinu na endoteliální funkci u lidí. Za tímto účelem byly hodnoceny vazomotorické a fibrinolytické funkce u zdravých mužů ve stavu farmakologicky indukované hyperleptinémie. V paralelní studii byla endoteliální funkce hodnocena u pacientů s prokázanou ICHS a vztahovala se k hladinám leptinu v plazmě.

Materiály a metody

Subjekty V Umeå ve Švédsku bylo přijato sedmnáct zdravých nekuřáků mužských dobrovolníků, kteří neužívali žádnou pravidelnou medikaci (tři muži se účastnili jak protokolu 1, tak protokolu 2). Z kardiologické ambulance v Royal Infirmary, Edinburgh, Skotsko, bylo přijato 83 pacientů s prokázanou ICHS a charakteristiky této kohorty byly popsány dříve. Tito pacienti měli stabilní anginu pectoris a měli předchozí angiografickou dokumentaci ≥50% luminální stenózy alespoň jedné velké epikardiální koronární cévy. Od každého subjektu byl získán písemný informovaný souhlas a studie byly provedeny v souladu s Helsinskou deklarací.

Venózní okluzní pletysmografie Subjekty se zdržely alkoholu po dobu 24 hodin a jídla, tabáku a nápojů obsahujících kofein alespoň 4 hodiny před každou studijní návštěvou. Všechny studie byly provedeny v tiché místnosti s řízenou teplotou udržovanou na 22-25 stupních Celsia (ºC). 17-G žilní kanyla byla zavedena do antekubitální žíly každé paže a brachiální arterie nedominantní paže byla kanylována jehlou 27-G (Cooper's Needle Works Ltd, UK). Oboustranný průtok krve předloktím byl měřen žilní okluzní pletysmografií pomocí mercury-in-silastic tenzometrů. Krevní tlak a srdeční frekvence byly měřeny pomocí poloautomatického neinvazivního tlakoměru. Aby se předešlo akutním vazomotorickým účinkům, byly ráno každé studie vysazeny všechny léky.

Studovat design

Protokol 1 Deseti zdravým mužským dobrovolníkům byl intraarteriálně podán rekombinantní lidský leptin (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, USA) ve vzestupných dávkách 80, 800 a 8 000 ng/min (vždy 6 minut). Srdeční frekvence, krevní tlak, průtok krve předloktím, leptin, antigen tkáňového aktivátoru plazminogenu (tPA) a koncentrace antigenu inhibitoru aktivátoru plazminogenu typu 1 (PAI-1) byly stanoveny na konci každé dávky.

Protokol 2 Ve dvojitě zaslepené randomizované zkřížené studii dostalo deset zdravých mužských dobrovolníků intraarteriální infuze buď leptinu (800 ng/min) nebo fyziologického roztoku při dvou různých příležitostech s alespoň 2 týdny mezi návštěvami. Průtok krve předloktím byl měřen v ramenech s infuzí a bez infuze na začátku a v pravidelných intervalech během jednohodinové infuze leptinu/fyziologického roztoku. Poté byly čtyři vazodilatátory infundovány současně s intraarteriálními infuzemi leptinu/fyziologického roztoku; bradykinin (vazodilatátor závislý na endotelu, který uvolňuje tPA) při 100, 300 a 1 000 pmol/min (Clinalfa Ltd, Švýcarsko), acetylcholin (vazodilatátor závislý na endotelu, který neuvolňuje tPA) při 5, 10 a 20 µg/min (Clinalfa Ltd. , Švýcarsko), nitroprusid sodný (vazodilatátor nezávislý na endotelu) při 2, 4 a 8 µg/min (David Bull laboratories, UK) a verapamil (vazodilatátor nezávislý na endotelu) při 10, 30, 100 µg/min (Abbott UK Ltd) po dobu 6 minut při každé koncentraci. Vazodilatátory byly podávány infuzí v náhodném pořadí s 15minutovou periodou vymývání fyziologickým roztokem mezi každým lékem. Verapamil byl vždy podáván nakonec pro jeho dlouhotrvající vazomotorické účinky.

Venózní krev byla získána z ramen s infuzí a bez infuze na začátku, před a během infuze bradykininu, po 60 minutách a na konci protokolu studie.

Protokol 3 U pacientů s CAD (n=83) byl měřen bilaterální průtok krve předloktím před a během intraarteriálních infuzí substance P (endotel-dependentní vazodilatátor, který uvolňuje tPA) při 2, 4 a 8 pmol/min (Clinalfa Ltd, Švýcarsko), acetylcholin při 5, 10 a 20 ug/min (jak je uvedeno výše) a nitroprusid sodný v 2, 4 a 8 ug/min (jak je uvedeno výše) po dobu 6 minut při každé koncentraci. Bradykinin nebyl podáván, protože mnoho subjektů bylo léčeno inhibicí angiotensin-konvertujícího enzymu, což výrazně zesiluje jeho vazodilatační a fibrinolytické účinky. Vasodilatátory byly podávány v náhodném pořadí s 15minutovou periodou vymývání fyziologickým roztokem mezi každým lékem. Vzorky žilní krve byly odebrány před a během intraarteriální infuze substance P pro měření fibrinolytických markerů.

Venózní odběr vzorků a testy Vzorky žilní krve nalačno byly odebrány do zkumavek obsahujících okyselený pufrovaný citrát nebo citrát trisodný. Vzorky byly okamžitě odebrány na led a centrifugovány při 2000 g po dobu 30 minut. Plazma a sérum bez krevních destiček byly před testem skladovány při -80 °C. Koncentrace mozkového natriuretického peptidu (BNP), cholesterolu a glukózy byly stanoveny podle klinické rutiny a vysoce citlivý C-reaktivní protein (hsCRP) pomocí vysoce citlivého testu s použitím částicově zesílené imunonefelometrie (Behring BN II nefelometr). Plazmatické koncentrace leptinu byly měřeny pomocí radioimunologického testu s dvojitou protilátkou (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA). Intra- a inter-testové variační koeficienty byly menší než 5 % při nízkých (2-4 ng/ml) i vysokých (10-15 ng/ml) koncentracích leptinu. Koncentrace tPA a antigenu PAI-1 v plazmě byly stanoveny pomocí enzymatických imunosorbentních testů (Coaliza®, Chromogenix Ltd) a aktivita tPA v plazmě za použití fotometrické metody (Coatest tPA, Chromogenix Ltd). Variační koeficienty pro fibrinolytické testy byly 5,9 % a 12 % pro antigen tPA a aktivitu a 6,2 % pro antigen PAI-1. Odhadované čisté uvolňování tPA (antigenu a aktivity) bylo vypočteno, jak bylo popsáno dříve, po každé dávce bradykininu nebo substance P, jako produkt průtoku plazmy předloktím podané infúzí a rozdílu v plazmatických hladinách mezi předloktím infundovaným a neinfundovaným.