炎症性肠病、细胞疗法和移植的精确诊断（PREDICT 试验） (PREDICT)

假设：

假设 1：研究人员假设他们可以定义导致炎症性肠病 (IBD) 和胃肠道 (GI) 急性 GVHD 的分子机制，并通过使用先进的免疫学分析（包括流式细胞术、TCR 深度测序和转录组学）将其与其他炎症性疾病区分开来.

假设 #2：研究人员进一步假设基于纵向系统的免疫学分析将能够针对患者特异性确定 IBD 以及急性和慢性 GVHD 的分子进化以及保护性免疫的移植后缺陷，并确定哪些途径，当受到干扰时，会引起临床疾病。 这些途径的发现将改进诊断、预后和治疗方法，并为接受造血干细胞移植 (HCT) 的患者制定个性化的治疗决策。

假设 3：我们假设我们可以定义过继性细胞疗法的不同决定因素所涉及的分子机制、表型和功能免疫学特征，包括与细胞疗法相关的功效、寿命和毒性。 使用包括流式细胞术、质谱、TCR 深度测序和单细胞转录组学在内的高级免疫学分析，对细胞疗法及其引发的内源性免疫反应进行纵向表征，将有助于识别和区分对疗效和毒性至关重要的途径，并实现后续的治疗调节。

假设 4：我们假设 IBD 患者和 HCT 接受者肠道微生物组的差异在疾病严重程度和两种疾病的总体临床结果（例如 菌血症、不明原因的发烧、死亡）。 通过下一代测序对肠道微生物群落的纵向表征将允许检测与观察到的临床变化一致的连续微生物变化。 在特定临床结果中反复观察到的微生物组显着变化的发现将导致对其病理生理学的更好的机械理解，并为未来的诊断和预防方法提供信息。

假设 5：我们假设与多种疾病相关的免疫失调会改变对疫苗的免疫反应，从而加剧这些人群对传染病的易感性。 具体而言，HCT 和实体器官移植受者，以及患有活动性或近期恶性肿瘤病史或自身免疫性疾病的患者，由于疾病病理生理学或治疗方案对 SARS-CoV-2 疫苗接种的影响，T 细胞和 B 细胞对 SARS-CoV-2 疫苗的反应可能会降低免疫功能。 全面的血清学分析、高参数流式细胞术以及 T 和 B 细胞 RNA 测序将能够纵向分析这些患者群体接种疫苗后的中和抗体滴度和抗原特异性 T 和 B 细胞扩增、表型、多样性和存活率，以及在相关和无关的健康控制中。 这些数据将为了解这些疾病中的免疫损伤如何导致对感染的不良反应提供机制见解。 由于 SARS-CoV-2 是一种病原体，许多人仍未接触过它，因此这是一个独特的机会，可以研究免疫功能低下的个体对新挑战的免疫反应。 此外，这些发现将为公共卫生指南提供信息，指导如何改进措施以保护弱势群体免受可预防疾病的侵害。

目标：

具体目标 1：确定 IBD 和 GI 急性 GVHD 的特异性机制，并将其与其他炎症性疾病区分开来。

目标 1：对从接受内窥镜检查的疑似 GI GVHD、炎症性肠病 (IBD) 和功能性胃肠道疾病 (FGID) 患者的 GI 组织样本中纯化的 T 细胞进行流式细胞术、TCR 深度测序和全转录组分析。

目的 2：对诊断为 GI GVHD、IBD 和 FGID 的患者进行内镜检查时外周血 T 细胞的流式细胞术、TCR 深度测序和转录组分析。

具体目标 2：描述导致 IBD、急性 GVHD、慢性 GVHD 和接受 HCT 的患者的保护性免疫缺陷的免疫失调。

目标 1：对从 IBD 患者和接受同种异体 HCT 的患者中纯化的 T 细胞和 B 细胞进行纵向免疫分析。 对于移植患者，我们将比较移植后发生急性和慢性 GVHD、复发和感染性并发症的患者的 T 和 B 细胞免疫力，并与没有这些并发症的患者进行比较。

目标 2：对 IBD 患者和接受 HCT 的患者进行纵向微生物组分析，以确定微生物组改变对移植后并发症发展的影响。

具体目标 3：确定分子和细胞免疫学机制，这些机制决定细胞疗法的临床反应，并区分成功抗肿瘤反应的关键途径与涉及不良反应的途径。

目标 1：在给药前表征细胞产物，并使用基于 qPCR 的转基因检测（如果适用）跟踪其在患者外周血和适用时骨髓、脑脊液和其他组织中的纵向分布、动力学、持久性和功能，流式细胞术、质谱细胞术、TCR 深度测序和对细胞产物中包含的 T 细胞和其他免疫细胞的全转录组分析。

目标 2：纵向探究细胞疗法与内源性免疫系统的相互作用，并描述内源性免疫反应在细胞疗法的疗效、持久性和毒性中的作用，使用流式细胞术、质谱细胞术、TCR 深度测序、全转录组分析对内源性免疫细胞和可溶性因子和抗体的分析。

具体目标 4：描述因癌症、移植或自身免疫性疾病导致免疫失调的患者对 SARS-CoV-2 疫苗接种的抗原特异性适应性免疫反应的特征，并确定持久免疫生成受损的潜在机制。

目标 1：在患者和健康对照者中对疫苗接种前后的血清学免疫（包括加强疫苗）进行综合纵向分析，包括评估 SARS-CoV-2 特异性抗体水平和中和抗体滴度。

目标 2：使用高参数流式细胞术、单细胞 RNA 测序 (scRNAseq) 以及 T 和 B 细胞库分析来表征在接种疫苗和随后的加强疫苗后抗原特异性 T 和 B 细胞记忆对 SARS-CoV-2 的纵向发展在患者和健康对照中。

目标 3：与健康对照相比，评估患者血清和克隆抗体对结合和中和病毒变体的反应能力。

背景与意义：

IBD：炎症性肠病 (IBD) 包括克罗恩病 (CD) 和溃疡性结肠炎 (UC)，是一种慢性复杂的胃肠道 (GI) 自身免疫性疾病，在美国有 140 万人患病1。 随着时间的推移，CD 和 UC 的发病率和患病率都在增加，并且涵盖了世界上更大的地区 1、2。 此外，小儿 IBD 占所有诊断出的 IBD 的 25%，使儿童终生患有胃肠道疾病并暴露于免疫抑制，尤其是在生长发育期间。 尽管对发病机制和遗传异常的研究正在进行，但 IBD 发展和进展背后的机制尚不清楚。 标准疗法仍然依赖于类固醇、其他非特异性免疫抑制（如甲氨蝶呤和硫唑嘌呤）和抗 TNF 生物制剂。 尽管阻断细胞因子和白细胞运输的药物等新疗法不断涌现，但尚未发现普遍成功的治疗方法。 因此，IBD 的复发形式继续导致营养吸收能力的系统性损害、贫血，并且经常导致需要手术干预。 破译驱动 IBD 独特亚型（甚至在 UC 和 CD 中）的机制，然后根据潜在的系统失调优化治疗是该领域未满足的关键需求。 虽然 IBD 的潜在免疫机制仍未确定，但有重要数据表明 IBD 可能代表遗传易感宿主对自身抗原和共生微生物群的不适当免疫反应 3。 因此，小鼠结肠炎模型表明，粘膜炎症是由病理性 T 辅助细胞 (Th) 反应以及调节细胞缺陷引起的。 这些数据来自 IL-2 缺陷小鼠4、IL-10 缺陷小鼠5、TGF-beta6 和 TGF-betaGRII 显性失活转基因小鼠 7 的实验。 发病机制还包括效应细胞反应的夸大，这是从 Stat4 转基因小鼠 8 和 TNFARE 突变小鼠 9 的实验中出现的。 最近的人类细胞因子分析表明，尽管临床相似，但 IBD 的每个亚型都显示出独特的细胞因子谱 10。 尽管最初的研究已经开始针对特定的效应 T 细胞通路 11，但靶器官转录组学的应用还处于起步阶段，个体可靶向通路仍然难以捉摸。

HCT：同种异体 HCT 是治疗恶性和非恶性血液病患者的有效方法。 然而，这种治疗复杂，发病率和死亡率高，限制了其更广泛的应用。 移植后发病率和死亡率的主要原因包括急性和慢性 GVHD、复发和传染病。 PREDICT 试验的目标是应用系统方法来理解驱动这些并发症的机制，以便可以设计出基于证据的治疗策略。

急性 GVHD：急性 GVHD 由供体衍生的同种异体反应性 T 细胞被激活并导致对宿主细胞的细胞毒性 12、13 以及细胞因子介导的组织损伤介导。 高达 60% 的接受 HCT 的患者可发生中度至重度急性 GVHD，并且更严重的形式与死亡率 >50%14-17 相关。 免疫介导的组织损伤最常见的部位是肝脏、皮肤和胃肠道 (GI)。 GI GVHD 发生在 40-50% 的 HCT 患者中，并且是该疾病发病率和死亡率的主要原因 17。

GI GVHD 的诊断源自临床和组织病理学发现。 GVHD 可发生在上消化道和下消化道，导致腹泻、腹痛、恶心、呕吐和/或厌食症状 12。 GI GVHD 的组织病理学诊断标准包括隐窝细胞凋亡、隐窝破坏和/或粘膜剥脱的鉴定 18。 不幸的是，组织学上 GVHD 的严重程度与疾病的临床过程相关性很低。

虽然 GI GVHD 是 HCT 后的常见并发症，但对其一致和准确的诊断仍有许多障碍。 首先，诊断取决于适当的组织取样。 可见病变通常不存在 19，内窥镜检查结果可能是弥漫性和非特异性的。 对于胃肠道活检的最佳位置或确保诊断所需的活检数量，也没有达成共识。 来自上消化道和下消化道的活检标本之间也经常存在不一致 20。 其次，在 GVHD 病程早期出现的患者可能有细微的组织病理学发现，这些发现可能被遗漏或尚未出现。 在 GVHD 开始时，可​​能会看到很少的凋亡细胞，隐窝丢失和粘膜损伤可能尚未发生 18。 最后，还有可能导致 GVHD 误诊的混杂因素，包括预处理方案相关毒性、伴随感染和药物，这些都可能导致胃肠道局灶性炎症。 在清髓性调节方案后的前 20 天内，可以看到模仿急性 GVHD21 的弥漫性细胞凋亡。 艰难梭菌和巨细胞病毒感染也可能具有相似的临床和组织病理学表现 22。 霉酚酸酯 23 和质子泵抑制剂 24 的使用也被发现与可能被误诊为 GVHD 的胃肠道细胞凋亡有关。 所有这些因素导致 GVHD18,25 的组织学诊断存在高度的观察者间变异性，并且与临床观察的相关性较差，说明需要更灵敏和更具体的诊断方法。

最近在鉴定具有诊断和预后意义的 GVHD 生物标志物方面取得了进展。 IL-8、IL-2 受体-α、肿瘤坏死因子受体-1 (TNF-1)、肝细胞生长因子 (HGF)、弹性蛋白、再生胰岛衍生 3-α (reg-3alpha)、TIM3、IL-6 、ST2、B 细胞激活因子 (BAFF)、IL-33、CXCL10 和 CXCL11 均被发现可用于预测 GVHD26-28 的发展。 虽然这些生物标志物已被确定，但它们尚未得到广泛验证，并且尚未在临床上被用作改变治疗的指南。 此外，迄今为止发现的生物标志物通常是下游通路扰动的结果，发现在疾病过程早期发生的上游失调可能对开发诊断或预后模型有价值，这些模型可能导致旨在改变自然过程的试验。这种病。

我们的小组之前已经表明，通过使用先进的免疫学分析，包括流式细胞术和全转录组分析，我们可以识别以前未被识别的在 GVHD29-31 中活跃的分子途径。 我们预计，通过在急性 GVHD 患者中使用系统免疫学方法，我们将能够确定具有诊断和预后价值的途径。 这可能会提高我们的诊断能力，最重要的是，使我们能够根据患者的特定免疫学特征对患者进行个体化管理。

慢性 GVHD：CGVHD 发生在 40-60% 的移植患者中32-35，并且这种疾病的发病率在过去 20 年中不断上升36 -40。 尽管慢性 GVHD 的频率增加，但仍然缺乏准确的诊断和循证治疗。 因此，虽然已经确定了慢性 GVHD 生物标志物，但还没有任何符合临床应用条件的生物标志物 41。 此外，这些生物标志物通常代表终末期通路扰动，可能由非特异性炎症和组织损伤以及反调节机制引起。 除了诊断方面的挑战外，还存在重大的治疗挑战：因此，慢性 GVHD 的治疗在过去几十年中没有发生重大变化。 一线治疗仍然是皮质类固醇，有或没有钙调磷酸酶抑制剂 (CNI)42-44，不幸的是，大约 50% 的患者会失败并需要二线治疗 45,46，二线治疗后 2 年的无失败生存率仅为 25% 47. 这些数据强调了该领域在分子诊断和循证治疗范例方面的重大未满足需求。

保护性免疫：除了急性和慢性 GVHD 的挑战外，接受 HCT 的患者和患有 IBD 的患者还面临其他毒性，其中许多与移植后免疫重建功能失调有关。 然而，尽管保护性免疫（针对传染性病原体和白血病复发）的许多缺陷的现象学已得到充分证明，但其致病分子机制仍然未知。 为了解决这些问题，我们小组和其他人已经开始对 HCT 后的免疫重建进行详细评估，包括应用新的 T 细胞受体 (TCR) 和 B 细胞受体 (BCR) 深度测序技术30,48-54。 这些技术允许在以前不可能的分子细节水平上研究移植后免疫重建的广度和深度，并有望加深我们对传染性病原体对全球免疫健康和免疫重建影响的理解。 这些技术的广泛应用，以及它们与免疫表型和功能详细评估的交叉，可以提供关于移植患者免疫健康状况的新见解，并有望确定需要新干预措施以改善移植后状况的患者免疫重建。

PREDICT 试验的目标是应用系统生物学方法对移植后的关键免疫结果进行精确诊断。 这种方法将加深我们对导致最致命的移植后并发症的分子机制的理解，并作为为移植患者设计循证治疗范例的关键平台。

细胞疗法：新型过继细胞疗法越来越多地进入临床试验，并可作为 FDA 批准的生物制剂使用，从而为先前难治性患者提供治疗选择。 这个广泛而令人兴奋的领域包括针对多种抗原的嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞 55、经过基因修饰以表达 TCR 的 T 细胞 56、57、细胞因子刺激的 NK 细胞 58，以及使用内源性辐射肿瘤的肿瘤疫苗方法样品 59 或用肿瘤抗原脉冲的免疫细胞。 60 嵌合抗原受体 T 细胞产生了显着的反应，特别是在患有 CD19+ B 细胞恶性肿瘤的患者中61-64，这导致 FDA 批准了几种产品。 虽然最初可以实现前所未有的临床缓解，但该方法经常受到反应的持久性和输注后 12 个月时 EFS 为 50%61 的 CAR T 细胞持久性、肿瘤逃逸机制65 以及涉及细胞因子释放综合征、神经系统毒性的显着毒性66 的限制. 在 CAR T 细胞疗法的背景下，成功应用的关键因素已经确定，包括共刺激信号机制的结合67、68、体内 CAR T 细胞扩增与反应的关联69 以及具有增殖能力和能力的 T 细胞表型亚群的贡献长期坚持70。 此外，关于 IL-6 和 IL-1 在细胞因子释放综合征和神经毒性 71,72 中的作用以及泛 T 细胞浸润和中枢神经系统中高细胞因子水平作为神经毒性介质 73 的贡献的重要见解已通过以下方式获得：我们的小组和其他人。 然而，应用系统方法询问成功反应的决定因素、毒性、与内源性免疫系统的相互作用以及旨在降低毒性的干预措施的短期和长期影响（例如施用 IL6R-拮抗剂 Tocilizumab 或 IL-1 阻断剂 74。

在这项研究中，我们旨在系统地研究细胞治疗产品的特性、体内给药后的演变以及在不同隔室（如外周血、骨髓、中枢神经系统和适用组织）中的行为及其与内源性免疫系统的相互作用。 将采用单细胞转录组学，结合 TCR 测序（适用时 BCR 测序）和转移和内源性免疫细胞的表型表征，以及血浆中分泌的免疫因子（如细胞因子、趋化因子和抗体）的分析，并将其与临床反应相关联. 这种公正、系统的精确诊断方法将允许识别关键途径，这些途径是常见的或不同的，具体取决于细胞治疗方法、目标和疾病实体的性质，以及与不良毒性相关或可分离的关键途径。 这将为未来细胞治疗的合理设计提供重要信息，并为细胞治疗后可能的治疗干预提供信息。

疫苗反应：干细胞和实体器官移植受者、患有当前或既往恶性肿瘤的患者以及患有自身免疫性疾病或风湿病（包括 IBD）的患者的一个共同主题是免疫调节受损，而免疫调节治疗的效果往往会加剧这种情况，包括放疗、化疗和长期免疫抑制。 尽管采取了对这些患者进行免疫的措施，但仍有 15% 的实体器官移植受者在移植后的头五年内因疫苗可预防的疾病住院（Feldman 等人，2019），这与显示对疫苗反应受损的研究一致这些患者（Madan 等人，2008 年；Mazzone 等人，2004 年）。 HCT 接受者对疫苗接种有不同程度的反应，但不会产生与健康对照组相同的反应幅度，如果他们也患有 GVHD，可能会进一步改变反应（Avetisyan 等人，2008 年；Shalabi 等人，2019 年）。 风湿病或自身免疫性疾病患者也被证明对特定疫苗的反应受损，尤其是在使用免疫调节剂（如 TNFalpha 阻断剂）时（Dell' Era 等人，2011 年）。 对儿童癌症幸存者的研究表明，免疫损伤可能会持续到疾病消退之后；未接受 HCT 的小儿白血病幸存者在治疗完成时体液免疫和适应性免疫受损（Perkins 等人，2017 年；Top 等人，2020 年），一些患者没有反应，而其他患者的免疫力可能减弱（Nilsson 等人，2020 年） ., 2002 年；Top 等人，2020 年），尽管有重新接种疫苗的尝试。 随着针对 SARS-CoV-2 的免疫接种工作变得广泛，了解免疫功能低下患者的疫苗反应对于制定更有效的策略来保护该人群免受严重的 COVID-19 感染至关重要，这可以外推到其他疫苗可预防的病原体。

在这项研究中，我们建议使用一种系统的方法来纵向分析患有多种免疫调节疾病的患者接种 SARS-CoV-2 疫苗后的体液和抗原特异性 T 细胞和 B 细胞反应。 将在疫苗接种之前和之后定期收集患者的血样。 我们将使用同种型特异性 ELISA 和中和抗体测定来评估长期抗体反应的持久性和强度。 高参数流式细胞术和 scRNAseq 将使抗原特异性 T 细胞和 B 细胞记忆细胞的高分辨率表型分析以及库分析成为可能，这可能会影响接种疫苗的患者免疫逃逸的可能性。 最后，这项研究将使我们能够确定来自免疫失调患者的克隆抗体或血清中和病毒变体的能力是否较差，从而深入了解患者克隆多样性的减少是否会导致对病毒变体的保护作用减弱。