Diagnósticos de precisão em doenças inflamatórias intestinais, terapia celular e transplante (o estudo PREDICT) (PREDICT)

Hipóteses:

Hipótese nº 1: Os investigadores levantam a hipótese de que podem definir os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela Doença Inflamatória Intestinal (DII) e GVHD gastrointestinal (GI) aguda e diferenciá-la de outras doenças inflamatórias usando análise imunológica avançada, incluindo citometria de fluxo, sequenciamento profundo de TCR e transcriptômica .

Hipótese nº 2: Os investigadores levantam a hipótese de que a análise imunológica baseada em sistemas longitudinais permitirá a determinação específica do paciente da evolução molecular da DII, bem como GVHD aguda e crônica, bem como defeitos pós-transplante na imunidade protetora e determinar quais vias, quando perturbado, pode causar doença clínica. A descoberta dessas vias levará a melhores abordagens diagnósticas, prognósticas e de tratamento e à tomada de decisões terapêuticas personalizadas para pacientes submetidos a transplante de células-tronco hematopoiéticas (HCT).

Hipótese #3: Nossa hipótese é que podemos definir os mecanismos moleculares, características imunológicas fenotípicas e funcionais envolvidas em determinantes distintos de terapias celulares adotivas, incluindo a eficácia, longevidade e toxicidade associadas à terapia celular. A caracterização longitudinal da terapêutica celular e a resposta imune endógena que eles provocam usando análise imunológica avançada, incluindo citometria de fluxo, espectrometria de massa, sequenciamento profundo de TCR e transcriptômica de célula única, permitirá a identificação e distinção de vias críticas para eficácia e toxicidade e possibilitará a modulação terapêutica subsequente.

Hipótese nº 4: Nossa hipótese é que as diferenças no microbioma intestinal de pacientes com DII e receptores de HCT desempenham um papel importante na gravidade da doença e nos resultados clínicos gerais em ambas as doenças (por exemplo, bacteremia, febres inexplicáveis, mortalidade). A caracterização longitudinal das comunidades microbianas intestinais por sequenciamento de próxima geração permitirá a detecção de alterações microbianas sequenciais que coincidem com as alterações clínicas observadas. a descoberta de mudanças significativas no microbioma que são observadas repetidamente com um resultado clínico específico levará a uma melhor compreensão mecanicista de sua fisiopatologia e informará futuras abordagens diagnósticas e preventivas.

Hipótese # 5: Nossa hipótese é que a desregulação imunológica associada a uma ampla gama de distúrbios alterará a resposta imune às vacinas, aumentando a suscetibilidade a doenças infecciosas nessas populações. Especificamente, receptores de TCH e transplante de órgãos sólidos, bem como pacientes com história ativa ou recente de malignidade, ou doenças autoimunes, podem ter respostas reduzidas de células T e B à vacinação contra SARS-CoV-2 devido ao efeito da fisiopatologia da doença ou regimes de tratamento em função imune. Análise sorológica abrangente, citometria de fluxo de alto parâmetro e sequenciamento de RNA de células T e B permitirão a análise longitudinal de títulos de anticorpos neutralizantes e expansão, fenótipo, diversidade e sobrevivência de células T e B específicas para antígenos após a vacinação nessas populações de pacientes, bem como em controles saudáveis ​​relacionados e não relacionados. Esses dados fornecerão uma visão mecanicista de como o comprometimento imunológico nesses distúrbios contribui para respostas inadequadas a infecções. como o SARS-CoV-2 é um patógeno ao qual grande parte da população permanece virgem, isso representa uma oportunidade única para estudar a resposta imune a um novo desafio em indivíduos imunocomprometidos. Além disso, essas descobertas informarão as diretrizes de saúde pública sobre como melhorar as medidas para proteger as populações vulneráveis ​​de doenças evitáveis.

Mira:

Objetivo Específico #1: Identificar os mecanismos específicos para IBD e GVHD agudo GI e delineá-lo de outros distúrbios inflamatórios.

Objetivo 1: Realizar citometria de fluxo, sequenciamento profundo de TCR e análise de transcriptoma total em células T purificadas de amostras de tecido GI retiradas de pacientes submetidos a endoscopia para GVHD GI presumido, doença inflamatória intestinal (DII) e doença gastrointestinal funcional (FGID).

Objetivo 2: Realizar citometria de fluxo, sequenciamento profundo de TCR e análise de transcriptoma em células T do sangue periférico no momento da endoscopia em pacientes diagnosticados com GVHD GI, DII e FGID.

Objetivo Específico #2: Caracterizar a desregulação imunológica responsável pela DII, GVHD aguda, GVHD crônica e defeitos na imunidade protetora em pacientes submetidos a HCT.

Objetivo 1: Realizar análise imune longitudinal em células T e células B purificadas de pacientes com DII e aqueles submetidos a TCH alogênico. Para pacientes transplantados, compararemos a imunidade de células T e B em pacientes que desenvolvem DECH aguda e crônica, recidiva e complicações infecciosas pós-transplante e comparamos com pacientes sem essas complicações.

Objetivo 2: Realizar a análise do microbioma longitudinalmente em pacientes com DII e naqueles submetidos a TCH para determinar o impacto das alterações do microbioma no desenvolvimento de complicações pós-transplante.

Objetivo Específico #3: Identificar os mecanismos imunológicos moleculares e celulares envolvidos na determinação da resposta clínica às terapias celulares e distinguir as vias críticas para uma resposta antitumoral bem-sucedida daquelas envolvidas em efeitos adversos.

Objetivo 1: Caracterizar o produto celular antes da administração e rastrear sua distribuição, cinética, persistência e função longitudinalmente in vivo no sangue periférico do paciente e, quando aplicável, medula óssea, LCR e outros tecidos, usando detecção de transgene baseada em qPCR (se aplicável), citometria de fluxo, citometria de massa, sequenciamento profundo de TCR e análise de transcriptoma total em células T e outras células imunes contidas no produto celular.

Objetivo 2: Interrogar longitudinalmente a interação da terapia celular com o sistema imunológico endógeno e delinear o papel da resposta imune endógena na eficácia, persistência e toxicidade da terapia celular, usando citometria de fluxo, citometria de massa, sequenciamento profundo de TCR, análise de transcriptoma total em células imunes endógenas e análise de fatores solúveis e anticorpos.

Objetivo Específico #4: Caracterizar a resposta imune adaptativa específica do antígeno à vacinação contra SARS-CoV-2 em pacientes com desregulação imunológica devido a câncer, transplante ou doença autoimune e identificar os mecanismos subjacentes à geração prejudicada de imunidade durável.

Objetivo 1: Realizar análise longitudinal abrangente da imunidade sorológica pré e pós-vacinação, incluindo vacinas de reforço, em pacientes e controles saudáveis, incluindo avaliação dos níveis de anticorpos específicos para SARS-CoV-2 e títulos de anticorpos neutralizantes.

Objetivo 2: Usar citometria de fluxo de alto parâmetro, sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e análise de repertório de células T e B para caracterizar o desenvolvimento longitudinal da memória de células T e B específicas de antígeno para SARS-CoV-2 após vacinação e vacinas de reforço subsequentes em pacientes e controles saudáveis.

Objetivo 3: Avaliar a capacidade de soros e anticorpos clonados de pacientes responderem para se ligar e neutralizar variantes virais, em comparação com controles saudáveis.

Antecedentes e Significado:

DII: A doença inflamatória intestinal (DII), que inclui a Doença de Crohn (DC) e a Colite Ulcerosa (UC), é uma condição autoimune gastrointestinal (GI) crônica complexa que afeta 1,4 milhão de pessoas nos Estados Unidos1. A incidência e prevalência de DC e CU estão aumentando ao longo do tempo e abrangendo áreas maiores do mundo1,2. Além disso, a DII pediátrica compreende 25% de todas as DII diagnosticadas, relegando a criança a uma doença gastrointestinal e exposição à imunossupressão, especialmente durante um período destinado ao crescimento e desenvolvimento. Apesar da pesquisa em andamento sobre a patogênese e anormalidades genéticas, o mecanismo por trás do desenvolvimento e progressão da DII não é bem compreendido. As terapias padrão ainda dependem de esteróides, outros imunossupressores não específicos (como metotrexato e azatioprina) e produtos biológicos anti-TNF. Embora novas terapias, como agentes que bloqueiam citocinas e tráfego de leucócitos, estejam surgindo, nenhum tratamento universalmente bem-sucedido foi identificado. Assim, as formas recidivantes de DII continuam levando ao comprometimento sistêmico da capacidade de absorção nutricional, anemia e, muitas vezes, à necessidade de intervenções cirúrgicas. Decifrar os mecanismos que conduzem os subtipos únicos de IBD (mesmo dentro da UC e DC) e otimizar o tratamento com base na desregulação sistêmica subjacente é uma necessidade crítica não atendida no campo. Embora o mecanismo imunológico subjacente da DII permaneça indeterminado, há dados significativos que sugerem que a DII pode representar uma resposta imune inadequada contra autoantígenos e microbiota comensal em um hospedeiro geneticamente suscetível3. Assim, os modelos de colite murina sugerem que a inflamação da mucosa resulta de respostas patológicas das células T auxiliares (Th), juntamente com defeitos celulares reguladores. Esses dados surgiram de experimentos em camundongos deficientes em IL-24, camundongos deficientes em IL-105, TGF-beta6 e camundongos transgênicos dominantes negativos para TGF-betaGRII7. A patogênese também inclui um exagero nas respostas das células efetoras, que surgiram a partir de experimentos em camundongos transgênicos Stat48 e camundongos mutantes TNFARE9. Mais recentemente, a análise de citocinas humanas sugere que, apesar das semelhanças clínicas, cada subtipo de DII apresenta perfis distintos de citocinas10. Embora os estudos iniciais tenham começado a direcionar as vias específicas das células T efetoras11, a aplicação da transcriptômica de órgãos-alvo está em sua infância e as vias segmentáveis ​​individuais ainda são ilusórias.

HCT: HCT alogênico é um tratamento eficaz para pacientes com doenças hematológicas malignas e não malignas. No entanto, este tratamento é complicado com altas taxas de morbidade e mortalidade limitando sua aplicação mais ampla. As principais causas de morbidade e mortalidade pós-transplante incluem DECH aguda e crônica, recidiva e doenças infecciosas. O objetivo do estudo PREDICT é aplicar uma abordagem de sistemas para entender os mecanismos que levam a essas complicações, de modo que estratégias de tratamento baseadas em evidências possam ser concebidas.

GVHD agudo: GVHD agudo é mediado por células T alo-reativas derivadas de doadores que se tornam ativadas e resultam em citotoxicidade contra células hospedeiras12,13, bem como dano tecidual mediado por citocinas. A DECH aguda moderada a grave pode ocorrer em até 60% dos pacientes submetidos ao TCH e as formas mais graves têm sido associadas a taxas de mortalidade > 50%14-17. Os locais mais comuns de dano tecidual mediado pelo sistema imunológico são o fígado, a pele e o trato gastrointestinal (GI). A DECH GI ocorre em 40-50% dos pacientes com TCH e é a principal causa de morbidade e mortalidade por essa doença17.

O diagnóstico de GVHD GI é derivado de achados clínicos e histopatológicos. A DECH pode ocorrer tanto no trato GI superior quanto no inferior, levando a sintomas de diarreia, dor abdominal, náusea, vômito e/ou anorexia12. Os critérios diagnósticos histopatológicos para GVHD GI incluem a identificação de apoptose das células criptográficas, destruição das criptas e/ou desnudamento da mucosa18. Infelizmente, a gravidade da GVHD na histologia é pouco correlacionada com o curso clínico da doença.

Embora GVHD GI seja uma complicação comum após HCT, permanecem muitas barreiras para seu diagnóstico consistente e preciso. Em primeiro lugar, o diagnóstico depende da amostragem adequada de tecidos. As lesões visíveis estão frequentemente ausentes19 e os achados endoscópicos podem ser difusos e inespecíficos. Também não há consenso sobre a localização ideal do trato GI para biópsias ou número de biópsias necessárias para garantir um diagnóstico. Também há discordância frequente entre os espécimes de biópsia do trato GI superior e inferior20. Em segundo lugar, os pacientes que se apresentam no início da DECH podem apresentar achados histopatológicos sutis que podem passar despercebidos ou ainda não estar presentes. No início da GVHD, poucas células apoptóticas podem ser vistas e perda de criptas e danos à mucosa podem ainda não ter ocorrido18. Por fim, também existem fatores de confusão que podem levar ao diagnóstico incorreto de GVHD, que incluem toxicidade relacionada ao regime de condicionamento, infecções concomitantes e medicamentos que podem causar inflamação focal do trato GI. Nos primeiros 20 dias após um regime de condicionamento mieloablativo, apoptose difusa pode ser observada mimetizando GVHD21 agudo. As infecções por Clostridium difficile e citomegalovírus também podem ter apresentações clínicas e histopatológicas semelhantes22. O uso de micofenolato de mofetil23 e inibidores da bomba de prótons24 também foram associados à apoptose do trato GI, que pode ser diagnosticada erroneamente como GVHD. Todos esses fatores levam ao alto grau de variabilidade interobservador no diagnóstico histológico da DECH18,25 e à baixa correlação com as observações clínicas, ilustrando a necessidade de métodos de diagnóstico mais sensíveis e específicos.

Houve avanços recentes na identificação de biomarcadores na DECH que têm significado diagnóstico e prognóstico. IL-8, receptor-alfa de IL-2, receptor-1 do fator de necrose tumoral (TNF-1), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), elafina, 3-alfa derivado de ilhotas em regeneração (reg-3alfa), TIM3, IL-6 , ST2, fator de ativação de células B (BAFF), IL-33, CXCL10 e CXCL11 têm utilidade na previsão do desenvolvimento de GVHD26-28. Embora esses biomarcadores tenham sido identificados, eles não foram amplamente validados e ainda precisam ser adotados clinicamente como um guia para alterar o tratamento. Além disso, os biomarcadores descobertos até agora são muitas vezes o resultado de perturbações da via a jusante e descobrir a desregulação a montante que ocorre no início do curso da doença pode ser valioso no desenvolvimento de modelos diagnósticos ou prognósticos que podem levar a ensaios destinados a alterar o curso natural da doença. a doença.

Nosso grupo mostrou anteriormente que, usando análise imunológica avançada, incluindo citometria de fluxo e análise de transcriptoma total, podemos identificar vias moleculares não reconhecidas anteriormente ativas na GVHD29-31. Prevemos que, ao utilizar uma abordagem imunológica de sistemas em pacientes com GVHD agudo, seremos capazes de identificar vias com valor diagnóstico e prognóstico. Isso pode aumentar nossa capacidade diagnóstica e, mais importante, nos permitir individualizar o manejo de pacientes com base em seus perfis imunológicos específicos.

DECH crônica: DECH crônica ocorre em 40-60% dos pacientes transplantados32-35 com a incidência dessa doença aumentando nas últimas 2 décadas36 DECH crônica causa mortalidade significativa e, nos pacientes que sobrevivem, pode resultar em efeitos profundos na qualidade de vida37 -40. Apesar do aumento da frequência de DECH crônica, ainda falta um diagnóstico preciso e uma terapia baseada em evidências. Assim, embora os biomarcadores de DECH crônica tenham sido identificados, ainda não há nenhum que se qualifique para aplicação clínica41. Além disso, esses biomarcadores geralmente representam perturbações da via em estágio final e podem resultar de inflamação inespecífica e dano tecidual, bem como de mecanismos contrarregulatórios. Além dos desafios no diagnóstico, também existem desafios significativos no tratamento: Assim, o tratamento da GVHD crônica não mudou significativamente nas últimas décadas. A terapia de primeira linha permanece com corticosteroides com ou sem inibidores de calcineurina (CNIs)42-44 e, infelizmente, aproximadamente 50% dos pacientes falharão e exigirão tratamento de segunda linha45,46 com sobrevida sem falha em 2 anos após a terapia de segunda linha sendo apenas 25% 47. Esses dados ressaltam as necessidades não atendidas significativas nesse campo, tanto para diagnóstico molecular quanto para paradigmas de tratamento baseados em evidências.

Imunidade protetora: Além dos desafios da GVHD aguda e crônica, os pacientes submetidos a TCH e aqueles com DII também enfrentam outras toxicidades, muitas das quais estão relacionadas à reconstituição imunológica disfuncional após o transplante. No entanto, embora a fenomenologia dos muitos defeitos na imunidade protetora (tanto contra patógenos infecciosos quanto contra a recidiva da leucemia) esteja bem documentada, os mecanismos moleculares causadores permanecem desconhecidos. Para responder a essas questões, nosso grupo e outros começaram a realizar avaliações detalhadas da reconstituição imunológica após HCT, incluindo a aplicação de novas tecnologias de sequenciamento profundo de receptores de células T (TCR) e receptores de células B (BCR)30,48-54. Essas tecnologias permitem a investigação da amplitude e profundidade da reconstituição imunológica pós-transplante em um nível de detalhe molecular que não era possível anteriormente e prometem aprofundar nossa compreensão do impacto de patógenos infecciosos na saúde imunológica global e na reconstituição imunológica. A ampla aplicação dessas tecnologias e sua interseção com a avaliação detalhada do fenótipo e da função imunológica podem fornecer novos insights sobre o estado da saúde imunológica em pacientes transplantados e prometem identificar pacientes que precisam de novas intervenções para melhorar sua saúde pós-transplante. reconstituição imune.

O objetivo do estudo PREDICT é aplicar uma abordagem de biologia de sistemas para permitir diagnósticos de precisão para os principais resultados imunológicos pós-transplante. Essa abordagem aprofundará nossa compreensão dos mecanismos moleculares que conduzem às complicações pós-transplante mais mortais e servirá como uma plataforma crítica sobre a qual projetar paradigmas de tratamento baseados em evidências para pacientes transplantados.

Terapia Celular: Novas terapias celulares adotivas estão cada vez mais entrando em ensaios clínicos e estão disponíveis como produtos biológicos aprovados pela FDA, fornecendo assim uma opção terapêutica para pacientes anteriormente refratários. Este campo amplo e excitante inclui células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigidas contra uma variedade de antígenos55, células T geneticamente modificadas para expressar TCRs56,57, células NK estimuladas por citocinas58, bem como abordagens de vacinas tumorais com tumor endógeno irradiado amostras59 ou células imunes pulsadas com antígeno tumoral.60 Células T receptoras de antígenos quiméricas levaram a respostas dramáticas, particularmente em pacientes com malignidades de células B CD19+61-64, levando à aprovação de vários produtos pela FDA. Embora remissões clínicas sem precedentes possam ser alcançadas inicialmente, a abordagem é frequentemente limitada pela durabilidade da resposta e persistência de células CAR T com EFS de 50% em 12 meses após a infusão61, mecanismos de escape do tumor65 e toxicidade significativa envolvendo síndrome de liberação de citocinas, toxicidade neurológica66 . No contexto da terapia com células CAR T, foram identificados fatores-chave para a aplicação bem-sucedida e incluem a incorporação de um mecanismo de sinalização co-estimulador67,68, associação de expansão de células CAR T in vivo com resposta69 e contribuição de subgrupos fenotípicos de células T com capacidade de proliferar e persistir a longo prazo70. Além disso, informações importantes sobre os papéis de IL-6 e IL-1 na síndrome de liberação de citocinas e neurotoxicidade71,72 e a contribuição de um infiltrado de células pan-T e altos níveis de citocinas no SNC como mediadores de neurotoxicidade73 foram obtidas por nosso grupo e outros. No entanto, há uma necessidade significativa não atendida de aplicar uma abordagem sistemática interrogando os determinantes de uma resposta bem-sucedida, toxicidade, interação com o sistema imunológico endógeno e efeitos de curto e longo prazo de intervenções destinadas a reduzir a toxicidade, como a administração do IL6R- antagonista Tocilizumabe ou bloqueio de IL-174.

Neste estudo pretendemos interrogar sistematicamente as características dos produtos de terapia celular, evolução após administração in vivo e comportamento em diferentes compartimentos como sangue periférico, medula óssea, SNC e se aplicável tecidos e sua interação com o sistema imunológico endógeno. A transcriptômica de célula única, juntamente com o sequenciamento de TCR (quando aplicável, o sequenciamento de BCR) e a caracterização fenotípica de células imunes transferidas e endógenas, bem como a análise de fatores imunes secretados, como citocinas, quimiocinas e anticorpos no plasma, serão empregadas e correlacionadas com respostas clínicas . Esta abordagem imparcial e sistemática de diagnóstico de precisão permitirá a identificação de vias críticas que são comuns ou distintas, dependendo da natureza da abordagem terapêutica celular, alvo e entidades da doença e associadas ou separáveis ​​de toxicidades indesejadas. Isso informará criticamente o futuro design racional da terapêutica celular e informará possíveis intervenções terapêuticas após a administração da terapia celular.

Respostas à vacina: Um tema comum entre receptores de transplante de células-tronco e órgãos sólidos, pacientes com malignidade atual ou anterior e pacientes com doença autoimune ou reumatológica, incluindo DII, é a regulação imune prejudicada, que é frequentemente agravada pelo efeito de tratamentos imunomodificadores , incluindo radiação, quimioterapia e imunossupressão a longo prazo. 15% dos receptores de transplante de órgãos sólidos são hospitalizados com uma doença evitável por vacinação nos primeiros cinco anos após o transplante, apesar das medidas para imunizar esses pacientes (Feldman et al., 2019), o que é consistente com estudos que mostram respostas prejudicadas às vacinas em esses pacientes (Madan et al., 2008; Mazzone et al., 2004). Os receptores de HCT respondem em graus variáveis ​​à vacinação, mas não apresentam a mesma magnitude de resposta que em controles saudáveis ​​e podem ter respostas ainda mais alteradas se também tiverem GVHD (Avetisyan et al., 2008; Shalabi et al., 2019). Pacientes com doenças reumatológicas ou autoimunes também demonstraram ter respostas prejudicadas a determinadas vacinas, especialmente se estiverem recebendo agentes imunomoduladores, como o bloqueio de TNFalfa (Dell' Era et al., 2011). Estudos de sobreviventes de câncer infantil sugerem que o comprometimento imunológico pode persistir além da resolução da doença; os sobreviventes de leucemia pediátrica que não recebem HCT têm imunidade humoral e adaptativa prejudicada na conclusão do tratamento (Perkins et al., 2017; Top et al., 2020), e alguns pacientes não respondem e outros podem ter diminuição da imunidade (Nilsson et al ., 2002; Top et al., 2020), apesar das tentativas de revacinação. À medida que os esforços de imunização contra o SARS-CoV-2 se generalizam, a compreensão da resposta à vacina em pacientes imunocomprometidos será fundamental para informar estratégias mais eficazes para proteger essa população do COVID-19 grave, que pode ser extrapolado para outros patógenos evitáveis ​​por vacina.

Neste estudo, propomos o uso de uma abordagem sistemática para perfilar longitudinalmente as respostas das células T e B humorais e específicas do antígeno após a vacinação contra SARS-CoV-2 em pacientes com uma ampla gama de doenças imunomodificadoras. Amostras de sangue dos pacientes serão coletadas antes e em intervalos regulares após a vacinação. Avaliaremos a durabilidade e a magnitude das respostas de anticorpos a longo prazo usando ELISAs específicos de isotipo e ensaios de anticorpos neutralizantes. Citometria de fluxo de alto parâmetro e scRNAseq permitirão fenotipagem de alta resolução de células de memória de células T e B específicas para antígenos, bem como análise de repertório, o que pode afetar a probabilidade de escape imune em pacientes vacinados. Finalmente, este estudo nos permitirá determinar se anticorpos clonados ou soro de pacientes com desregulação imune são menos capazes de neutralizar variantes virais, fornecendo informações sobre se a diversidade clonal reduzida em pacientes pode resultar em menor proteção contra variantes virais.