Прецизионная диагностика воспалительных заболеваний кишечника, клеточная терапия и трансплантация (исследование PREDICT) (PREDICT)

Гипотезы:

Гипотеза № 1. Исследователи предполагают, что они могут определить молекулярные механизмы, ответственные за воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и острую РТПХ желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), и дифференцировать его от других воспалительных заболеваний с помощью расширенного иммунологического анализа, включая проточную цитометрию, глубокое секвенирование TCR и транскриптомику. .

Гипотеза № 2. Исследователи также предполагают, что лонгитюдный иммунологический анализ на основе систем позволит определить для конкретного пациента молекулярную эволюцию ВЗК, а также острую и хроническую РТПХ, а также посттрансплантационные дефекты защитного иммунитета и определить, какие пути, при возмущении может вызвать клиническое заболевание. Открытие этих путей приведет к улучшению диагностических, прогностических и лечебных подходов, а также к принятию персонализированных терапевтических решений для пациентов, перенесших трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК).

Гипотеза № 3. Мы предполагаем, что можем определить молекулярные механизмы, фенотипические и функциональные иммунологические характеристики, связанные с различными детерминантами адоптивной клеточной терапии, включая эффективность, продолжительность жизни и токсичность, связанные с клеточной терапией. Продольная характеристика клеточных терапевтических средств и эндогенного иммунного ответа, который они вызывают, с использованием расширенного иммунологического анализа, включая проточную цитометрию, масс-спектрометрию, глубокое секвенирование TCR и транскриптомику отдельных клеток, позволит идентифицировать и различить пути, важные для эффективности и токсичности, и сделать возможным последующую терапевтическую модуляцию.

Гипотеза № 4. Мы предполагаем, что различия в микробиоме кишечника пациентов с ВЗК и реципиентов ТГСК играют важную роль в тяжести заболевания и общих клинических исходах при обоих заболеваниях (например, бактериемия, необъяснимая лихорадка, смертность). Продольная характеристика микробных сообществ кишечника с помощью секвенирования следующего поколения позволит обнаружить последовательные микробные изменения, которые совпадают с наблюдаемыми клиническими изменениями. обнаружение значительных изменений в микробиоме, которые неоднократно наблюдаются при определенном клиническом исходе, приведет к лучшему механистическому пониманию его патофизиологии и даст информацию для будущих диагностических и профилактических подходов.

Гипотеза № 5. Мы предполагаем, что нарушение регуляции иммунной системы, связанное с широким спектром заболеваний, изменит иммунный ответ на вакцины, усугубляя восприимчивость к инфекционным заболеваниям в этих группах населения. В частности, реципиенты HCT и трансплантатов паренхиматозных органов, а также пациенты с активной или недавней историей злокачественных новообразований или аутоиммунных заболеваний могут иметь сниженный Т- и В-клеточный ответ на вакцинацию против SARS-CoV-2 из-за влияния патофизиологии заболевания или схем лечения на иммунная функция. Комплексный серологический анализ, высокопараметрическая проточная цитометрия и секвенирование РНК Т- и В-клеток позволят провести продольный анализ титров нейтрализующих антител и антиген-специфической экспансии Т- и В-клеток, фенотипа, разнообразия и выживаемости после вакцинации в этих популяциях пациентов, а также в родственном и неродственном здоровом контроле. Эти данные обеспечат механистическое понимание того, как иммунные нарушения при этих расстройствах способствуют плохой реакции на инфекции. поскольку SARS-CoV-2 является патогеном, к которому большая часть населения остается наивной, это представляет собой уникальную возможность изучить иммунный ответ на новый вызов у ​​людей с ослабленным иммунитетом. Кроме того, эти результаты будут использованы в руководящих принципах общественного здравоохранения о том, как улучшить меры по защите уязвимых групп населения от предотвратимых заболеваний.

Цели:

Конкретная цель № 1: определить механизмы, характерные для ВЗК и острой РТПХ желудочно-кишечного тракта, и отличить ее от других воспалительных заболеваний.

Цель 1: Выполнить проточную цитометрию, глубокое секвенирование TCR и анализ всего транскриптома на Т-клетках, очищенных из образцов тканей ЖКТ, взятых у пациентов, которые проходят эндоскопию по поводу предполагаемой желудочно-кишечной РТПХ, воспалительного заболевания кишечника (ВЗК) и функционального желудочно-кишечного заболевания (ФЖК).

Цель 2: Выполнить проточную цитометрию, глубокое секвенирование TCR и анализ транскриптома Т-клеток из периферической крови во время эндоскопии у пациентов с диагнозом GI GVHD, IBD и FGID.

Конкретная цель № 2: Охарактеризовать иммунологическую дисрегуляцию, ответственную за ВЗК, острую РТПХ, хроническую РТПХ и дефекты защитного иммунитета у пациентов, перенесших ТГСК.

Цель 1: Провести продольный иммунный анализ Т-клеток и В-клеток, очищенных от пациентов с ВЗК и тех, кто подвергается аллогенной HCT. Для пациентов, перенесших трансплантацию, мы сравним Т- и В-клеточный иммунитет у пациентов, у которых развилась острая и хроническая РТПХ, рецидив и инфекционные осложнения после трансплантации, и сравним с пациентами без этих осложнений.

Задача 2: Продольно провести анализ микробиома у пациентов с ВЗК и пациентов, перенесших ТГСК, чтобы определить влияние изменений микробиома на развитие посттрансплантационных осложнений.

Конкретная цель № 3: Определить молекулярные и клеточные иммунологические механизмы, участвующие в определении клинического ответа на клеточную терапию, и отличить пути, важные для успешного противоопухолевого ответа, от путей, участвующих в побочных эффектах.

Задача 1: Охарактеризовать клеточный продукт перед введением и отслеживать его распределение, кинетику, стойкость и функцию в продольном направлении in vivo в периферической крови пациента и, если применимо, в костном мозге, спинномозговой жидкости и других тканях, используя обнаружение трансгена на основе количественной ПЦР (если применимо). проточная цитометрия, масс-цитометрия, глубокое секвенирование TCR и анализ всего транскриптома Т-клеток и других иммунных клеток, содержащихся в клеточном продукте.

Задача 2: Продольно изучить взаимодействие клеточной терапии с эндогенной иммунной системой и определить роль эндогенного иммунного ответа в эффективности, стойкости и токсичности клеточной терапии с использованием проточной цитометрии, масс-цитометрии, глубокого секвенирования TCR, полного анализа транскриптома. на эндогенные иммунные клетки и анализ растворимых факторов и антител.

Конкретная цель № 4: охарактеризовать антиген-специфический адаптивный иммунный ответ на вакцинацию против SARS-CoV-2 у пациентов с нарушением регуляции иммунитета из-за рака, трансплантации или аутоиммунного заболевания и определить механизмы, лежащие в основе нарушения формирования стойкого иммунитета.

Задача 1: Провести комплексный лонгитюдный анализ серологического иммунитета до и после вакцинации, в том числе к бустерным вакцинам, у пациентов и здоровых людей, включая оценку уровней специфических антител против SARS-CoV-2 и титров нейтрализующих антител.

Задача 2: использовать проточную цитометрию с высокими параметрами, секвенирование РНК одиночных клеток (scRNAseq) и анализ репертуара Т- и В-клеток, чтобы охарактеризовать продольное развитие антиген-специфической памяти Т- и В-клеток к SARS-CoV-2 после вакцинации и последующих бустерных вакцин. у пациентов и здорового контроля.

Задача 3: оценить способность сыворотки и клонированных антител пациентов реагировать на связывание и нейтрализацию вариантов вируса по сравнению со здоровым контролем.

Предыстория и значение:

ВЗК: воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), которое включает болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК), представляет собой хроническое комплексное аутоиммунное заболевание желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), которым страдают 1,4 миллиона человек в Соединенных Штатах1. Заболеваемость и распространенность как БК, так и ЯК со временем увеличиваются и охватывают все большие территории мира1,2. Кроме того, педиатрическое ВЗК составляет 25% всех диагностированных ВЗК, что обрекает ребенка на всю жизнь с желудочно-кишечными заболеваниями и подверженностью иммуносупрессии, особенно в период, предназначенный для роста и развития. Несмотря на продолжающиеся исследования патогенеза и генетических аномалий, механизм развития и прогрессирования ВЗК изучен недостаточно. Стандартные методы лечения по-прежнему основаны на стероидах, других неспецифических иммунодепрессантах (таких как метотрексат и азатиоприн) и биологических препаратах против ФНО. Хотя появляются новые методы лечения, такие как агенты, которые блокируют цитокины и перенос лейкоцитов, универсально успешных методов лечения не выявлено. Таким образом, рецидивирующие формы ВЗК продолжают приводить к системному нарушению абсорбционной способности питательных веществ, анемии и часто к необходимости хирургических вмешательств. Расшифровка механизмов, управляющих уникальными подтипами ВЗК (даже в пределах ЯК и БК), а затем оптимизация лечения на основе лежащей в основе системной дисрегуляции является критической неудовлетворенной потребностью в этой области. Хотя лежащий в основе иммунный механизм ВЗК остается неясным, имеются важные данные, позволяющие предположить, что ВЗК может представлять собой неадекватную иммунную реакцию на аутоантигены и комменсальную микробиоту у генетически предрасположенного хозяина3. Таким образом, мышиные модели колита предполагают, что воспаление слизистой оболочки является результатом патологических ответов Т-хелперов (Th) клеток, наряду с дефектами регуляторных клеток. Эти данные были получены в результате экспериментов на мышах с дефицитом IL-24, мышах с дефицитом IL-105, TGF-бета6 и TGF-бетаGRII-доминантно-отрицательных трансгенных мышах7. Патогенез также включает преувеличение ответов эффекторных клеток, которые возникли в экспериментах на трансгенных Stat4 мышах8 и мутантных мышах TNFARE9. Более поздний анализ цитокинов человека показал, что, несмотря на клиническое сходство, каждый подтип ВЗК демонстрирует различные профили цитокинов10. Хотя первоначальные исследования начали нацеливаться на специфические пути эффекторных Т-клеток 11 , применение транскриптомики органов-мишеней находится в зачаточном состоянии, и индивидуальные пути, на которые можно нацеливаться, все еще неуловимы.

HCT: Аллогенная HCT является эффективным методом лечения пациентов со злокачественными и незлокачественными гематологическими заболеваниями. Однако это лечение осложнено высокими показателями заболеваемости и смертности, что ограничивает его более широкое применение. Ведущими причинами посттрансплантационной заболеваемости и смертности являются острая и хроническая РТПХ, рецидивы и инфекционные заболевания. Цель исследования PREDICT — применить системный подход к пониманию механизмов, вызывающих эти осложнения, чтобы можно было разработать стратегии лечения, основанные на доказательствах.

Острая РТПХ. Острая РТПХ опосредована активацией донорских аллореактивных Т-клеток, что приводит к цитотоксичности в отношении клеток-хозяев12,13, а также к опосредованному цитокинами повреждению тканей. Умеренная или тяжелая острая РТПХ может возникать у 60% пациентов, перенесших ТГСК, а более тяжелые формы связаны со смертностью >50%14-17. Наиболее частыми участками иммуноопосредованного повреждения тканей являются печень, кожа и желудочно-кишечный тракт (ЖКТ). GI GVHD встречается у 40-50% пациентов с HCT и является основной причиной заболеваемости и смертности от этого заболевания17.

Диагноз желудочно-кишечной РТПХ ставится на основании клинических и гистопатологических данных. РТПХ может возникать как в верхних, так и в нижних отделах желудочно-кишечного тракта, приводя к симптомам диареи, болей в животе, тошноты, рвоты и/или анорексии12. Гистопатологические диагностические критерии РТПХ ЖКТ включают выявление апоптоза клеток крипт, разрушения крипт и/или обнажения слизистой оболочки18. К сожалению, тяжесть РТПХ по гистологии плохо коррелирует с клиническим течением заболевания.

Хотя желудочно-кишечная РТПХ является частым осложнением после ТГСК, остается много препятствий для его последовательной и точной диагностики. Во-первых, диагноз зависит от соответствующего образца ткани. Видимые поражения часто отсутствуют19, а эндоскопические данные могут быть диффузными и неспецифическими. Также нет единого мнения об оптимальном расположении желудочно-кишечного тракта для биопсии или количестве биопсий, необходимых для подтверждения диагноза. Также часто наблюдается несоответствие между образцами биопсии из верхних и нижних отделов желудочно-кишечного тракта20. Во-вторых, у пациентов с ранним течением РТПХ могут быть тонкие гистопатологические признаки, которые могут быть пропущены или еще не обнаружены. В начале РТПХ можно увидеть несколько апоптотических клеток, а потеря крипт и повреждение слизистой оболочки могут еще не произойти18. Наконец, существуют также искажающие факторы, которые могут привести к ошибочному диагнозу РТПХ, включая токсичность, связанную с режимом кондиционирования, сопутствующие инфекции и лекарства, которые могут вызывать очаговое воспаление желудочно-кишечного тракта. В первые 20 дней после миелоаблативного режима кондиционирования можно наблюдать диффузный апоптоз, имитирующий острую РТПХ21. Clostridium difficile и цитомегаловирусная инфекция также могут иметь схожие клинические и гистопатологические проявления22. Также было обнаружено, что использование микофенолата мофетила23 и ингибиторов протонной помпы24 связано с апоптозом желудочно-кишечного тракта, который может быть ошибочно диагностирован как РТПХ. Все эти факторы приводят к высокой степени межнаблюдательной вариабельности гистологического диагноза РТПХ18,25 и плохой корреляции с клиническими наблюдениями, что свидетельствует о необходимости более чувствительных и специфичных методов диагностики.

В последнее время достигнуты успехи в идентификации биомаркеров РТПХ, имеющих диагностическое и прогностическое значение. IL-8, IL-2 рецептор-альфа, рецептор фактора некроза опухоли-1 (TNF-1), фактор роста гепатоцитов (HGF), элафин, регенерирующий островковый 3-альфа (рег-3альфа), TIM3, IL-6 Было обнаружено, что , ST2, фактор активации B-клеток (BAFF), IL-33, CXCL10 и CXCL11 полезны для прогнозирования развития GVHD26-28. Несмотря на то, что эти биомаркеры были идентифицированы, они еще не прошли всестороннюю проверку и должны быть клинически приняты в качестве руководства для изменения лечения. Более того, обнаруженные к настоящему времени биомаркеры часто являются результатом нарушений нисходящего пути, и обнаружение нарушения регуляции восходящего потока, которое происходит на более ранних стадиях заболевания, может быть ценным для разработки диагностических или прогностических моделей, которые могут привести к испытаниям, направленным на изменение естественного течения болезни. болезнь.

Наша группа ранее показала, что с помощью расширенного иммунологического анализа, включая проточную цитометрию и анализ всего транскриптома, мы можем идентифицировать ранее неизвестные молекулярные пути, активные при РТПХ29-31. Мы ожидаем, что, используя подход системной иммунологии у пациентов с острой РТПХ, мы сможем идентифицировать пути, которые имеют диагностическое и прогностическое значение. Это может повысить наши диагностические возможности и, что наиболее важно, позволить нам индивидуализировать ведение пациентов на основе их специфических иммунологических профилей.

Хроническая РТПХ: хроническая РТПХ встречается у 40-60% пациентов после трансплантации32-35, причем заболеваемость этим заболеванием возросла за последние 2 десятилетия36. -40. Несмотря на возросшую частоту хронической РТПХ, до сих пор отсутствует точная диагностика и доказательная терапия. Таким образом, несмотря на то, что биомаркеры хронической РТПХ были идентифицированы, еще не найдено ни одного, подходящего для клинического применения41. Более того, эти биомаркеры часто представляют собой нарушения метаболического пути на конечной стадии и могут быть результатом неспецифического воспаления и повреждения тканей, а также контррегуляторных механизмов. В дополнение к проблемам диагностики существуют и серьезные проблемы лечения: Таким образом, лечение хронической РТПХ не претерпело существенных изменений за последние несколько десятилетий. Терапия первой линии остается кортикостероидами с ингибиторами кальциневрина (ИКН) или без них42-44, и, к сожалению, примерно у 50% пациентов лечение второй линии оказывается неэффективным45,46, при этом безрецидивная выживаемость через 2 года после терапии второй линии составляет всего 25% 47. Эти данные подчеркивают значительные неудовлетворенные потребности в этой области, как в молекулярной диагностике, так и в парадигмах лечения, основанных на доказательствах.

Защитный иммунитет: в дополнение к проблемам острой и хронической РТПХ пациенты, перенесшие ТГСК, и пациенты с ВЗК также сталкиваются с другими видами токсичности, многие из которых связаны с дисфункциональным восстановлением иммунитета после трансплантации. Однако, хотя феноменология многих дефектов защитного иммунитета (как против инфекционных патогенов, так и против рецидивов лейкемии) хорошо документирована, причинные молекулярные механизмы остаются неизвестными. Чтобы ответить на эти вопросы, наша группа и другие специалисты начали проводить детальную оценку иммунологического восстановления после ТГСК, включая применение новых технологий глубокого секвенирования Т-клеточных рецепторов (TCR) и В-клеточных рецепторов (BCR)30,48-54. Эти технологии позволяют исследовать широту и глубину восстановления иммунитета после трансплантации на уровне молекулярной детализации, который ранее был невозможен, и обещают углубить наше понимание влияния инфекционных патогенов на глобальное иммунное здоровье и восстановление иммунитета. Широкое применение этих технологий и их взаимосвязь с детальной оценкой иммунного фенотипа и функции могут дать новое представление о состоянии иммунного здоровья у пациентов после трансплантации и обещают выявление пациентов, нуждающихся в новых вмешательствах для улучшения их состояния после трансплантации. восстановление иммунитета.

Целью исследования PREDICT является применение системно-биологического подхода для обеспечения точной диагностики ключевых иммунологических исходов после трансплантации. Этот подход углубит наше понимание молекулярных механизмов, вызывающих самые смертельные посттрансплантационные осложнения, и послужит важной платформой для разработки научно обоснованных парадигм лечения пациентов, перенесших трансплантацию.

Клеточная терапия. Новые методы адоптивной клеточной терапии все чаще проходят клинические испытания и доступны в качестве биопрепаратов, одобренных FDA, тем самым обеспечивая терапевтический вариант для ранее рефрактерных пациентов. Эта широкая и захватывающая область включает Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR), направленные против различных антигенов55, Т-клетки, генетически модифицированные для экспрессии TCR56,57, цитокин-стимулированные NK-клетки58, а также подходы противоопухолевой вакцины с эндогенной, облученной опухолью. образцы59 или иммунные клетки, обработанные опухолевым антигеном60. Химерные Т-клетки антиген-рецептор привели к резкому ответу, особенно у пациентов с В-клеточными злокачественными новообразованиями CD19+61-64, что привело к одобрению FDA нескольких продуктов. Хотя на начальном этапе можно достичь беспрецедентной клинической ремиссии, этот подход часто ограничивается длительностью ответа и персистенцией CAR Т-клеток с БСВ 50% через 12 месяцев после инфузии61, механизмами ускользания опухоли65 и значительной токсичностью, включающей синдром высвобождения цитокинов, неврологическую токсичность66 . В контексте терапии CAR Т-клетками были определены ключевые факторы для успешного применения, которые включают в себя включение костимулирующего сигнального механизма67,68, ассоциацию размножения CAR Т-клеток in vivo с ответом69 и вклад фенотипических подгрупп Т-клеток со способностью к пролиферации и сохраняться длительное время70. Кроме того, важное понимание роли IL-6 и IL-1 в синдроме высвобождения цитокинов и нейротоксичности71,72, а также вклад пан-Т-клеточной инфильтрации и высоких уровней цитокинов в ЦНС в качестве медиаторов нейротоксичности 73 было получено наша группа и др. Тем не менее, существует значительная неудовлетворенная потребность в применении систематического подхода к изучению факторов, определяющих успешный ответ, токсичности, взаимодействия с эндогенной иммунной системой и краткосрочных и долгосрочных эффектов вмешательств, направленных на снижение токсичности, таких как введение IL6R- антагонист тоцилизумаб или блокада ИЛ-174.

В этом исследовании мы стремимся систематически исследовать характеристики продуктов клеточной терапии, эволюцию после введения in vivo и поведение в различных отделах, таких как периферическая кровь, костный мозг, ЦНС и, если применимо, ткани и их взаимодействие с эндогенной иммунной системой. Транскриптомика отдельных клеток в сочетании с секвенированием TCR (когда применимо секвенирование BCR) и фенотипическая характеристика перенесенных и эндогенных иммунных клеток, а также анализ секретируемых иммунных факторов, таких как цитокины, хемокины и антитела, в плазме будут использоваться и коррелировать с клиническими ответами. . Этот беспристрастный, систематический подход к прецизионной диагностике позволит идентифицировать критические пути, которые являются общими или различными в зависимости от характера клеточного терапевтического подхода, мишени и форм заболевания, а также связаны или отделяются от нежелательной токсичности. Это критически важно для будущего рационального дизайна клеточной терапии и информирования о возможных терапевтических вмешательствах после введения клеточной терапии.

Реакция на вакцины: общей темой среди реципиентов стволовых клеток и трансплантированных органов, пациентов с текущим или предшествующим злокачественным новообразованием, а также пациентов с аутоиммунными или ревматологическими заболеваниями, включая ВЗК, является нарушение иммунной регуляции, которое часто усугубляется эффектом иммуномодулирующего лечения. включая лучевую терапию, химиотерапию и длительную иммуносупрессию. 15% реципиентов паренхиматозных органов госпитализируются с вакциноуправляемым заболеванием в течение первых пяти лет после трансплантации, несмотря на меры по иммунизации этих пациентов (Feldman et al., 2019), что согласуется с исследованиями, показывающими нарушение реакции на вакцины в у этих пациентов (Madan et al., 2008; Mazzone et al., 2004). Реципиенты HCT в разной степени реагируют на вакцинацию, но не достигают такой же величины ответа, как у здоровых людей из контрольной группы, и могут иметь дополнительные измененные ответы, если у них также есть РТПХ (Avetisyan et al., 2008; Shalabi et al., 2019). Также было показано, что у пациентов с ревматологическими или аутоиммунными заболеваниями наблюдается нарушение ответа на определенные вакцины, особенно на иммуномодулирующие агенты, такие как блокада ФНО-альфа (Dell' Era et al., 2011). Исследования детей, перенесших рак, показывают, что иммунные нарушения могут сохраняться после разрешения болезни; дети, перенесшие лейкемию и не получающие HCT, имеют нарушения гуморального и адаптивного иммунитета по завершении лечения (Perkins et al., 2017; Top et al., 2020), и некоторые пациенты не реагируют, а у других иммунитет может снижаться (Nilsson et al. ., 2002; Top et al., 2020), несмотря на попытки ревакцинации. Поскольку усилия по иммунизации против SARS-CoV-2 становятся широко распространенными, понимание реакции на вакцину у пациентов с ослабленным иммунитетом будет иметь решающее значение для информирования о более эффективных стратегиях защиты этой группы населения от тяжелой формы COVID-19, которые можно экстраполировать на другие патогены, которые можно предотвратить с помощью вакцин.

В этом исследовании мы предлагаем использовать систематический подход к продольному профилированию гуморальных и антиген-специфических Т- и В-клеточных ответов после вакцинации против SARS-CoV-2 у пациентов с широким спектром иммуномодулирующих заболеваний. Образцы крови у пациентов будут собираться до и через регулярные промежутки времени после вакцинации. Мы будем оценивать устойчивость и величину долгосрочных ответов антител, используя изотип-специфические ИФА и анализы нейтрализующих антител. Проточная цитометрия с высокими параметрами и scRNAseq позволят провести фенотипирование с высоким разрешением антиген-специфических Т- и В-клеток памяти, а также анализ репертуара, что может повлиять на вероятность ускользания от иммунного ответа у вакцинированных пациентов. Наконец, это исследование позволит нам определить, способны ли клонированные антитела или сыворотка пациентов с нарушениями иммунной регуляции в меньшей степени нейтрализовать вирусные варианты, что даст представление о том, может ли снижение клонального разнообразия у пациентов привести к меньшей защите от вирусных вариантов.