Precisionsdiagnostik vid inflammatorisk tarmsjukdom, cellterapi och transplantation (The PREDICT Trial) (PREDICT)

Hypoteser:

Hypotes #1: Utredarna antar att de kan definiera de molekylära mekanismerna som är ansvariga för inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) och gastrointestinal (GI) akut GVHD och skilja den från andra inflammatoriska störningar genom att använda avancerad immunologisk analys inklusive flödescytometri, TCR-djupsekvensering och transkriptomi .

Hypotes #2: Utredarna antar vidare att longitudinell systembaserad immunologisk analys kommer att möjliggöra patientspecifik bestämning av den molekylära utvecklingen av IBD såväl som akuta och kroniska GVHD samt post-transplantationsdefekter i skyddande immunitet, och bestämma vilka vägar, när störd kan orsaka klinisk sjukdom. Upptäckten av dessa vägar kommer att leda till förbättrade diagnostiska, prognostiska och behandlingsmetoder, och till personligt terapeutiskt beslutsfattande för patienter som genomgår hematopoetisk stamcellstransplantation (HCT).

Hypotes #3: Vi antar att vi kan definiera de molekylära mekanismerna, fenotypiska och funktionella immunologiska egenskaper som är involverade i distinkta bestämningsfaktorer för adoptiv cellterapi, inklusive effektivitet, livslängd och toxicitet förknippad med cellulär terapi. Longitudinell karakterisering av cellulär terapi och det endogena immunsvaret de framkallar med hjälp av avancerad immunologisk analys inklusive flödescytometri, masspektrometri, TCR djupsekvensering och encellstranskriptomik kommer att möjliggöra identifiering och distinktion av vägar som är kritiska för effektivitet och toxicitet och möjliggöra efterföljande terapeutisk modulering.

Hypotes #4: Vi antar att skillnader i tarmmikrobiomet hos patienter med IBD och mottagare av HCT spelar en viktig roll i sjukdomens svårighetsgrad och övergripande kliniska resultat i båda sjukdomarna (t. bakteriemi, oförklarlig feber, dödlighet). Den longitudinella karakteriseringen av de mikrobiella samhällena i tarmen genom nästa generations sekvensering kommer att möjliggöra upptäckt av sekventiella mikrobiella förändringar som sammanfaller med observerade kliniska förändringar. upptäckten av betydande förändringar i mikrobiomet som upprepade gånger observeras med ett visst kliniskt resultat kommer att leda till bättre mekanistisk förståelse av dess patofysiologi och informera framtida diagnostiska och förebyggande tillvägagångssätt.

Hypotes #5: Vi antar att immunförstöring associerad med ett brett spektrum av störningar kommer att förändra immunsvaret mot vacciner, vilket förvärrar känsligheten för infektionssjukdomar i dessa populationer. Specifikt kan mottagare av HCT och solida organtransplantationer, såväl som patienter med aktiv eller nyligen anamnes av malignitet eller autoimmuna sjukdomar ha minskat T- och B-cellssvar på SARS-CoV-2-vaccination på grund av effekten av sjukdomens patofysiologi eller behandlingsregimer på immun funktion. Omfattande serologisk analys, högparameterflödescytometri och T- och B-cell-RNA-sekvensering kommer att möjliggöra longitudinell analys av neutraliserande antikroppstitrar och antigenspecifik T- och B-cellsexpansion, fenotyp, mångfald och överlevnad efter vaccination i dessa patientpopulationer, såväl som i relaterade och icke-relaterade friska kontroller. Dessa data kommer att ge mekanistisk insikt i hur immunförsämring i dessa sjukdomar bidrar till dåliga svar på infektioner. eftersom SARS-CoV-2 är en patogen som en stor del av befolkningen förblir naiv mot, representerar detta en unik möjlighet att studera immunsvaret på en ny utmaning hos immunförsvagade individer. Dessutom kommer dessa resultat att informera folkhälsoriktlinjer om hur man kan förbättra åtgärder för att skydda utsatta befolkningar från sjukdomar som kan förebyggas.

Mål:

Specifikt mål #1: Att identifiera de mekanismer som är specifika för IBD och GI akut GVHD och avgränsa den från andra inflammatoriska störningar.

Mål 1: Utföra flödescytometri, TCR-djupsekvensering och heltranskriptomanalys på T-celler renade från GI-vävnadsprover tagna från patienter som genomgår endoskopi för förmodad GI GVHD, inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) och funktionell gastrointestinal sjukdom (FGID).

Mål 2: Utföra flödescytometri, TCR-djupsekvensering och transkriptomanalys på T-celler från det perifera blodet vid tidpunkten för endoskopi hos patienter som diagnostiserats med GI GVHD, IBD och FGID.

Specifikt mål #2: Karakterisera den immunologiska dysregleringen som är ansvarig för IBD, akut GVHD, kronisk GVHD och defekter i skyddande immunitet hos patienter som genomgår HCT.

Mål 1: Utför longitudinell immunanalys på T-celler och B-celler renade från patienter med IBD och de som genomgår allogen HCT. För transplantationspatienter kommer vi att jämföra T- och B-cellsimmunitet hos patienter som utvecklar akut och kronisk GVHD, återfall och infektiösa komplikationer efter transplantation och jämföra med patienter utan dessa komplikationer.

Mål 2: Utför mikrobiomanalys longitudinellt hos patienter med IBD och de som genomgår HCT för att fastställa effekten av mikrobiomförändringar i utvecklingen av komplikationer efter transplantation.

Specifikt mål #3: Identifiera de molekylära och cellulära immunologiska mekanismerna som är involverade i att bestämma det kliniska svaret på cellulära terapier och särskilja vägar som är avgörande för ett framgångsrikt antitumörsvar från de som är involverade i biverkningar.

Mål 1: Karakterisera den cellulära produkten före administrering och spåra dess distribution, kinetik, persistens och funktion longitudinellt in vivo i patientens perifera blod och i tillämpliga fall benmärg, CSF och andra vävnader, med hjälp av qPCR-baserad transgendetektion (om tillämpligt). flödescytometri, masscytometri, TCR-djupsekvensering och heltranskriptomanalys på T-celler och andra immunceller som ingår i den cellulära produkten.

Mål 2: Undersök longitudinellt samspelet mellan den cellulära terapin och det endogena immunsystemet och avgränsa rollen av det endogena immunsvaret i cellulär terapis effektivitet, persistens och toxicitet, med hjälp av flödescytometri, masscytometri, TCR-djupsekvensering, analys av hela transkriptomer om endogena immunceller och analys av lösliga faktorer och antikroppar.

Specifikt mål #4: Karakterisera det antigenspecifika adaptiva immunsvaret mot SARS-CoV-2-vaccination hos patienter med immunförstöring på grund av cancer, transplantation eller autoimmun sjukdom och identifiera mekanismer som ligger till grund för nedsatt generering av varaktig immunitet.

Mål 1: Utför omfattande longitudinell analys av serologisk immunitet före och efter vaccination, inklusive för att boostervaccinera, hos patienter och friska kontroller, inklusive bedömning av SARS-CoV-2-specifika antikroppsnivåer och neutraliserande antikroppstitrar.

Mål 2: Använd högparameterflödescytometri, encellig RNA-sekvensering (scRNAseq) och T- och B-cellsrepertoaranalys för att karakterisera den longitudinella utvecklingen av antigenspecifikt T- och B-cellsminne till SARS-CoV-2 efter vaccination och efterföljande boostervacciner hos patienter och friska kontroller.

Mål 3: Bedöma förmågan hos sera och klonade antikroppar från patienter att svara på att binda och neutralisera virala varianter, jämfört med friska kontroller.

Bakgrund och betydelse:

IBD: Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) som inkluderar Crohns sjukdom (CD) och ulcerös kolit (UC), är ett kroniskt komplext gastrointestinalt (GI) autoimmunt tillstånd som drabbar 1,4 miljoner människor i USA1. Incidensen och prevalensen av både CD och UC ökar över tiden och omfattar större delar av världen1,2. Dessutom omfattar pediatrisk IBD 25 % av all diagnostiserad IBD, vilket förvisar barnet till en livstid av gastrointestinala sjukdomar och exponering för immunsuppression, särskilt under en period avsedd för tillväxt och utveckling. Trots pågående forskning om patogenes och genetiska abnormiteter, är mekanismen bakom IBD-utveckling och progression inte väl förstått. Standardterapier är fortfarande beroende av steroider, annan ospecifik immunsuppression (som metotrexat och azatioprin) och biologiska läkemedel mot TNF. Även om nyare terapier som medel som blockerar cytokiner och handel med leukocyter dyker upp, har inga universellt framgångsrika behandlingar identifierats. Sålunda fortsätter återfallande former av IBD att leda till systemisk kompromiss i näringsabsorptionsförmåga, anemi och ofta till behovet av kirurgiska ingrepp. Att dechiffrera mekanismerna som driver de unika subtyperna av IBD (även inom UC och CD) och sedan optimera behandlingen baserat på den underliggande systemiska dysregulationen är ett kritiskt otillfredsställt behov inom området. Även om den underliggande immunmekanismen för IBD förblir obestämd, finns det betydande data som tyder på att IBD kan representera ett olämpligt immunsvar mot självantigener och kommensal mikrobiota i en genetiskt mottaglig värd3. Således antyder murina kolitmodeller att slemhinneinflammation är ett resultat av patologiska T-hjälpar-(Th)-cellsvar, tillsammans med regulatoriska celldefekter. Dessa data har framkommit från experiment i IL-2-deficienta möss4, IL-10-deficienta möss5, TGF-beta6 och TGF-betaGRII dominanta negativa transgena möss7. Patogenesen inkluderar också en överdrift i effektorcellsvar, som har uppstått från experiment i Stat4 transgena möss8 och TNFARE mutantmöss9. På senare tid tyder analys av humana cytokiner på att trots kliniska likheter visar varje subtyp av IBD distinkta cytokinprofiler10. Även om initiala studier har börjat rikta sig mot specifika effektor-T-cellsvägar11, är tillämpningen av målorgantranskriptomik i sin linda och individuella målbara vägar är fortfarande svårfångade.

HCT: Allogen HCT är en effektiv behandling för patienter med maligna och icke-maligna hematologiska sjukdomar. Denna behandling är dock komplicerad med höga frekvenser av sjuklighet och dödlighet som begränsar dess bredare tillämpning. De främsta orsakerna till sjuklighet och mortalitet efter transplantation inkluderar akut och kronisk GVHD, återfall och infektionssjukdomar. Målet med PREDICT-studien är att tillämpa en systemansats för att förstå mekanismerna som driver dessa komplikationer, så att evidensbaserade behandlingsstrategier kan utformas.

Akut GVHD: Akut GVHD medieras av donatorhärledda alloreaktiva T-celler som aktiveras och resulterar i cytotoxicitet mot värdceller12,13 såväl som cytokinmedierad vävnadsskada. Måttlig till svår akut GVHD kan förekomma hos upp till 60 % av patienterna som genomgår HCT och de mer allvarliga formerna har associerats med dödlighet >50 %14-17. De vanligaste platserna för den immunmedierade vävnadsskadan är levern, huden och mag-tarmkanalen. GI GVHD förekommer hos 40-50 % av HCT-patienter och är den främsta orsaken till sjuklighet och dödlighet i denna sjukdom17.

Diagnosen GI GVHD härleds från kliniska och histopatologiska fynd. GVHD kan förekomma i både övre och nedre mag-tarmkanalen vilket leder till symtom på diarré, buksmärtor, illamående, kräkningar och/eller anorexi12. Histopatologiska diagnostiska kriterier för GI GVHD inkluderar identifiering av kryptcellsapoptos, kryptförstöring och/eller slemhinneavbildning18. Tyvärr är svårighetsgraden av GVHD på histologin dåligt korrelerad med det kliniska förloppet av sjukdomen.

Även om GI GVHD är en vanlig komplikation efter HCT, finns det fortfarande många hinder för dess konsekventa och korrekta diagnos. För det första är diagnosen beroende av lämplig vävnadsprovtagning. Synliga lesioner saknas ofta19 och endoskopiska fynd kan vara diffusa och ospecifika. Det finns inte heller någon konsensus om den optimala placeringen av mag-tarmkanalen för biopsier eller antalet biopsier som behövs för att säkra en diagnos. Det finns också ofta oenighet mellan biopsiprover från övre och nedre GI-kanalen20. För det andra kan patienter som uppträder tidigt i förloppet av GVHD ha subtila histopatologiska fynd som kan missas eller ännu inte närvarande. Vid uppkomsten av GVHD kan få apoptotiska celler ses och kryptförlust och slemhinneskada kan ännu inte ha inträffat18. Slutligen finns det också förvirrande faktorer som kan leda till feldiagnostik av GVHD som inkluderar konditioneringsrelaterad toxicitet, samtidiga infektioner och mediciner som alla kan orsaka fokal inflammation i mag-tarmkanalen. Under de första 20 dagarna efter en myeloablativ konditioneringsregim kan diffus apoptos ses som efterliknar akut GVHD21. Clostridium difficile och cytomegalovirusinfektioner kan också ha liknande kliniska och histopatologiska presentationer22. Användning av mykofenolatmofetil23 och protonpumpshämmare24 har också funnits associerad med apoptos i mag-tarmkanalen som kan feldiagnostiseras som GVHD. Alla dessa faktorer leder till den höga graden av inter-observatörsvariabilitet i den histologiska diagnosen GVHD18,25 och dålig korrelation med de kliniska observationerna, vilket illustrerar behovet av mer känsliga och specifika diagnosmetoder.

Det har gjorts nyligen framsteg i identifieringen av biomarkörer i GVHD som har diagnostisk och prognostisk betydelse. IL-8, IL-2-receptor-alfa, tumörnekrosfaktorreceptor-1 (TNF-1), hepatocyttillväxtfaktor (HGF), elafin, regenererande ö-härledd 3-alfa (reg-3alfa), TIM3, IL-6 , ST2, B-cellsaktiverande faktor (BAFF), IL-33, CXCL10 och CXCL11 har alla visat sig ha användbarhet för att förutsäga utvecklingen av GVHD26-28. Även om dessa biomarkörer har identifierats har de inte validerats i stor utsträckning och har ännu inte antagits kliniskt som en guide för att ändra behandling. Dessutom är de biomarkörer som hittills upptäckts ofta resultatet av störningar i nedströms vägen och att upptäcka den uppströms dysregleringen som inträffar tidigare under sjukdomsförloppet kan vara värdefullt för att utveckla diagnostiska eller prognostiska modeller som kan leda till försök som syftar till att förändra det naturliga förloppet av sjukdomen. sjukdomen.

Vår grupp har tidigare visat att vi genom att använda avancerad immunologisk analys inklusive flödescytometri och hel transkriptomanalys kan identifiera tidigare okända molekylära vägar aktiva i GVHD29-31. Vi förutser att genom att använda ett systemimmunologiskt tillvägagångssätt hos patienter med akut GVHD kommer vi att kunna identifiera vägar som har diagnostiskt och prognostiskt värde. Detta kan förbättra vår diagnostiska kapacitet och viktigast av allt, tillåta oss att individualisera behandlingen av patienter baserat på deras specifika immunologiska profiler.

Kronisk GVHD: CGVHD förekommer hos 40–60 % av transplantationspatienterna32–35 med en ökning av incidensen av denna sjukdom under de senaste 2 decennierna36 kronisk GVHD orsakar betydande dödlighet, och hos de patienter som överlever kan det resultera i djupgående effekter på livskvaliteten37 -40. Trots den ökade frekvensen av kronisk GVHD saknas fortfarande korrekt diagnos och evidensbaserad terapi. Så även om kroniska GVHD-biomarkörer har identifierats har det ännu inte funnits några som kvalificerar sig för klinisk tillämpning41. Dessutom representerar dessa biomarkörer ofta störningar i slutstadiet och kan vara resultatet av ospecifik inflammation och vävnadsskada såväl som motreglerande mekanismer. Utöver utmaningarna i diagnostik finns det också betydande behandlingsutmaningar: Behandlingen av kronisk GVHD har således inte förändrats nämnvärt under de senaste decennierna. Första linjens behandling förblir kortikosteroider med eller utan kalcineurinhämmare (CNIs) 42-44 och tyvärr kommer cirka 50 % av patienterna att misslyckas och behöva andra linjens behandling45,46 med felfri överlevnad 2 år efter andra linjens behandling endast 25 % 47. Dessa data understryker de betydande otillfredsställda behoven inom detta område, både för molekylär diagnostik och evidensbaserade behandlingsparadigm.

Skyddande immunitet: Förutom utmaningarna med akut och kronisk GVHD, möter patienter som genomgår HCT och de med IBD också andra toxiciteter, av vilka många är relaterade till dysfunktionell immunrekonstitution efter transplantation. Men även om fenomenologin med de många defekterna i skyddande immunitet (både mot infektiösa patogener och mot leukemi återfall) är väldokumenterad, förblir de orsakande molekylära mekanismerna okända. För att ta itu med dessa frågor har vår grupp och andra börjat utföra detaljerade bedömningar av immunologisk rekonstitution efter HCT inklusive tillämpningen av nya T-cellsreceptorer (TCR) och B-cellsreceptorer (BCR) djupsekvenseringsteknologier30,48-54. Dessa teknologier möjliggör undersökning av bredden och djupet av immunrekonstitution efter transplantation på en nivå av molekylär detalj som inte tidigare varit möjlig och har löftet om att fördjupa vår förståelse av infektiösa patogeners inverkan på global immunhälsa och immunrekonstitution. Den utbredda tillämpningen av dessa teknologier, och deras skärningspunkt med detaljerad bedömning av immunfenotyp och funktion kan ge nya insikter om tillståndet för immunhälsan hos transplanterade patienter, och har löftet om att identifiera patienter i behov av nya ingrepp för att förbättra deras eftertransplantation. immunrekonstitution.

Målet med PREDICT-studien är att tillämpa ett systembiologiskt tillvägagångssätt för att möjliggöra precisionsdiagnostik för de immunologiska nyckelresultaten efter transplantation. Detta tillvägagångssätt kommer att fördjupa vår förståelse för de molekylära mekanismerna som driver de mest dödliga komplikationerna efter transplantation och fungera som en kritisk plattform för att utforma evidensbaserade behandlingsparadigm för transplanterade patienter.

Cellterapi: Nya adoptiva cellterapier går allt mer in i kliniska prövningar och är tillgängliga som FDA-godkända biologiska läkemedel, vilket ger ett terapeutiskt alternativ för tidigare refraktära patienter. Detta breda och spännande område inkluderar chimär-antigenreceptor (CAR) T-celler riktade mot en mängd olika antigener55, T-celler genetiskt modifierade för att uttrycka TCRs56,57, cytokinstimulerade NK-celler58, såväl som tumörvaccinmetoder med endogena, bestrålade tumörer prover59 eller immunceller pulserade med tumörantigen.60 Chimära antigen-receptor T-celler har lett till dramatiska svar, särskilt hos patienter med CD19+ B-cellsmaligniteter61-64, vilket leder till FDA-godkännande av flera produkter. Även om oöverträffade kliniska remissioner kan uppnås initialt, är tillvägagångssättet ofta begränsat av responsens hållbarhet och CAR T-cells persistens med en EFS på 50 % vid 12 månader efter infusion61, tumörflyktmekanismer65 och signifikant toxicitet som involverar cytokinfrisättningssyndrom, neurologisk toxicitet66 . I samband med CAR T-cellsterapi har nyckelfaktorer för framgångsrik applikation identifierats och inkluderar inkorporering av en samstimulerande signalmekanism67,68, association av in vivo CAR T-cellexpansion med respons69 och bidrag från T-cells fenotypiska subgrupper med kapacitet att proliferera och kvarstår på lång sikt70. Dessutom har viktiga insikter i rollerna för IL-6 och IL-1 i cytokinfrisättningssyndrom och neurotoxicitet71,72 och bidraget från ett pan-T-cellsinfiltrat och höga cytokinnivåer i CNS som mediatorer av neurotoxicitet 73 erhållits av vår grupp och andra. Det finns dock ett betydande otillfredsställt behov av att tillämpa ett systematiskt tillvägagångssätt som förhör bestämningsfaktorerna för ett framgångsrikt svar, toxicitet, interaktion med det endogena immunsystemet och kort- och långtidseffekter av interventioner som syftar till att minska toxiciteten, såsom administrering av IL6R- antagonist Tocilizumab eller IL-1-blockad74.

I denna studie syftar vi till att systematiskt undersöka egenskaperna hos cellterapiprodukter, utveckling efter administrering in vivo och beteende i olika avdelningar såsom perifert blod, benmärg, CNS och om tillämpligt vävnader och deras samspel med det endogena immunsystemet. Encellstranskriptomik, kopplad med TCR-sekvensering (när tillämpligt BCR-sekvensering) och fenotypisk karakterisering av överförda och endogena immunceller samt analys av utsöndrade immunfaktorer såsom cytokiner, kemokiner och antikroppar i plasman kommer att användas och korreleras med kliniska svar . Detta opartiska, systematiska precisionsdiagnostiska tillvägagångssätt kommer att möjliggöra identifiering av kritiska vägar som är vanliga eller distinkta beroende på arten av det cellterapeutiska tillvägagångssättet, mål- och sjukdomsenheter och associerade eller separata från oönskade toxiciteter. Detta kommer att kritiskt informera framtida rationella design av cellulär terapi och informera om möjliga terapeutiska ingrepp efter administrering av cellterapi.

Vaccinsvar: Ett vanligt tema bland mottagare av stamcells- och organtransplanterade, patienter med nuvarande eller tidigare malignitet och patienter med autoimmun eller reumatologisk sjukdom, inklusive IBD, är nedsatt immunreglering, vilket ofta förvärras av effekten av immunmodifierande behandlingar , inklusive strålning, kemoterapi och långvarig immunsuppression. 15 % av mottagare av solida organtransplantationer läggs in på sjukhus med en sjukdom som kan förebyggas med vaccin under de första fem åren efter transplantationen trots åtgärder för att immunisera dessa patienter (Feldman et al., 2019), vilket överensstämmer med studier som visar försämrade svar på vacciner i dessa patienter (Madan et al., 2008; Mazzone et al., 2004). HCT-mottagare svarar i varierande grad på vaccination, men får inte samma svarsgrad som hos friska kontroller, och kan ha ytterligare förändrade svar om de också har GVHD (Avetisyan et al., 2008; Shalabi et al., 2019). Patienter med reumatologisk eller autoimmun sjukdom har också visat sig ha försämrade svar på vissa vacciner, särskilt om de använder immunmodulerande medel som TNFalfa-blockad (Dell' Era et al., 2011). Studier av barncanceröverlevande tyder på att immunförsämring kan kvarstå bortom sjukdomsupplösning; pediatriska leukemiöverlevande som inte får HCT har nedsatt humoral och adaptiv immunitet vid avslutad behandling (Perkins et al., 2017; Top et al., 2020), och vissa patienter svarar inte, och andra kan ha avtagande immunitet (Nilsson et al. ., 2002; Top et al., 2020) trots återvaccinationsförsök. När immuniseringsinsatser mot SARS-CoV-2 blir utbredda, kommer insikter om vaccinresponsen hos patienter med nedsatt immunförsvar att vara avgörande för att informera om mer effektiva strategier för att skydda denna befolkning från allvarlig covid-19, som kan extrapoleras till andra patogener som kan förebyggas med vaccin.

I denna studie föreslår vi att använda ett systematiskt tillvägagångssätt för att longitudinellt profilera humorala och antigenspecifika T- och B-cellsvar efter SARS-CoV-2-vaccination hos patienter med ett brett spektrum av immunmodifierande sjukdomar. Blodprover från patienter kommer att samlas in före, och med jämna mellanrum efter, vaccination. Vi kommer att bedöma hållbarheten och omfattningen av långsiktiga antikroppssvar med hjälp av isotypspecifika ELISA och neutraliserande antikroppsanalyser. Flödescytometri med hög parametrar och scRNAseq kommer att möjliggöra högupplöst fenotypning av antigenspecifika T- och B-cellsminnesceller, såväl som repertoaranalys, vilket kan påverka sannolikheten för immunflykt hos vaccinerade patienter. Slutligen kommer denna studie att tillåta oss att avgöra om klonade antikroppar eller serum från patienter med immunförstöring har mindre förmåga att neutralisera virala varianter, vilket ger insikt om huruvida minskad klonal mångfald hos patienter kan resultera i mindre skydd mot virala varianter.