Inokulace pacientů s celiakií lidským hákem Necator Americanus: Hodnocení imunity a citlivosti na lepek

Pozadí a cíle: Řada důkazů naznačuje, že vymizení helmintů z lidské populace ve vyspělých zemích může být odpovědné za vzestup autoimunitních onemocnění, tzv. hygienické hypotézy. Naším cílem je pomocí malé kohorty zdravých jedinců s klidovou celiakií otestovat, zda všudypřítomný měchovec (HW) lidí, Necator americanus, inhibuje imunitní reakci na glutenovou výzvu (GC). Kromě toho, že je tato studie potenciálním přínosem pro lidi s intolerancí lepku, poskytne příležitost k podrobnému prozkoumání interakce hostitel-parazit na slizniční úrovni a základní imunitní odpovědi a potažmo potenciálu infekce háďátky na modulovat zánětlivou odpověď u IBD. Na rozdíl od experimentálních hlístových infekcí buď u zvířat geneticky predisponovaných ke kolitidě, nebo u klinického IBD (kde je přítomna řada komplikujících kofaktorů), tato studie se zabývá tím, co se děje u zdravých lidí, kteří nemají pozadí expozice helmintům a kteří nejsou v současné době ohroženi buď zánětem nebo imunosupresivními léky.

Metody: Bude vybráno dvacet zdravých dospělých s dobře zdokumentovanou celiakií (fenotyp DQ2), kteří dodržují bezlepkovou (GF) dietu po dobu ≥ 6 měsíců (na základě anamnézy a normální tkáňové transglutaminázy [tTG]), které budou náhodně rozděleny do dvou skupiny po deseti. Deset bude naočkováno larvami měchovce (HW) a 10 bude sloužit jako neinfikované kontroly. Subjekty studie a zkoušející budou zaslepeni, aby bylo možné porovnávat aktivitu onemocnění a imunitní profily. Larvy HW budou kultivovány z výkalů dodaných dobrovolným dárcem, dříve infikovaným pro tento účel. Konvenční endoskopie a biopsie budou prováděny dvakrát u každého subjektu, před a po orálním a rektálním GC (2x50g plátky pšeničného chleba dvakrát denně po dobu 3-5 dnů a 6g lepku ve 40ml kaši nakapané do konečníku na endoskop, v daném pořadí). Rektální biopsie bude provedena 4 hodiny a duodenální biopsie bude odebrána šest dní po GC; krev bude odebrána před a po získání infekce měchovcem a šestý den po GC. Pro srovnání tedy budou nashromážděny čtyři soubory dat: deset pacientů s GF celiakií před HW infekcí; 10 GF celiakie po HW infekci; deset GC celiakií před HW infekcí; a 10 GC celiakií po HW infekci.

Bezpečnost: K dispozici je velké množství pozorovacích údajů dokumentujících bezpečnost experimentální infekce měchovcem, a to jak z našich vlastních, tak ze studií jiných. Dva z našich výzkumníků udržovali infekce včetně občasných "doplňovacích" inokulací po dobu tří let bez škodlivých účinků.

Výstupní opatření: Budou zahrnovat: deník symptomů subjektu, úplnou analýzu krve, C-reaktivní protein, celkový a specifický IgE a aktivitu sérové ​​tryptázy. Duodenální (Marshova klasifikace) a rektální histologii bude hodnotit jeden patolog. Pohárkové buňky a slizniční T buňky budou obarveny, aby se napomohlo kvantifikaci odpovědí. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) a slizniční lymfocyty ze střevních biopsií budou pěstovány ex vivo a vystaveny imunodominantnímu peptidu glutenového antigenu (alfa-gliadin 57-73 Q65E, QLQPFPQPELPYPQPQS). Buněčná proliferace a cytokinové profily v reakci na HW a glutenové antigeny budou měřeny z PBMC a střevních biopsií. Změna načasování inokulace může poskytnout hodnotný směr ohledně důležitosti Th2 reakce pouze v případě, že existuje hluboký rozdíl mezi nově vytvořenými (dominantní Th2) a zralými (Th-neutrálními) parazitickými infekcemi, jak naznačuje naše dřívější práce s experimentálními lidské infekce. Úrovně transkripce požadovaných genů budou hodnoceny pomocí kvantitativní PCR v reálném čase a mikročipů.

Výsledky: Nulová hypotéza je, že Necator americanus nemění imunitní proces dostatečně k potlačení citlivosti na lepek u lidí s celiakií. Naměřené výsledky odrážejí aktivitu celiakie včetně závažnosti zánětu sliznice a charakter a intenzitu imunitních procesů. Tato studie je však stejně tak o IBD. Celiakie není IBD, ale tento model IBD poskytuje dříve neprozkoumanou příležitost otestovat kvazi autoimunitní reakce v duodenu a konečníku na specifický antigen, který lze na požádání zavést nebo vyloučit. Imunitní profilování se zaměří na charakteristiky, které řídí zánět u IBD, a poskytne jasný pohled na potenciál helmintů u Crohnovy choroby a ulcerózní kolitidy.

Extension Study; Kontrolní pacienti pozvaní k zařazení do prodloužení studie; každý by měl být naočkován, provokován a vyšetřen podle původní kohorty měchovcovitých (jak je uvedeno výše).

Studie s nízkou dávkou glutenu: Toto rozšíření studie se snaží zjistit, zda by infekce měchovcem mohla zlepšit toleranci k malým množstvím lepku u pacientů s celiakií. Studium je otevřené. Využívá pacientů s celiakií, kteří jsou již infikovaní měchovcem a u kterých byly pečlivě zdokumentovány základní charakteristiky krve a sliznice. Expozice lepku bude aplikována v dávkách, u kterých ostatní ve zkušebním prostředí prokázali, že jsou bezpečné a dobře tolerované. Účinnost infekce měchovcem na zmírnění intolerance lepku bude měřena kvantifikovatelnými změnami, ke kterým dochází v dříve odebraných biopsiích (před provokační expozicí) ve srovnání s tkání odebranou po provokaci. Histologie bude provedena tak, jak bylo popsáno dříve. Biopsie mají být fixovány v neutrálním pufrovaném formalínu, zpracovány a pečlivě orientovány a zality v parafínovém vosku. Řezy (3 μm) budou obarveny hematoxylinem a eosinem (H&E) a imunobarveny protilátkami anti-CD8 (nebo anti-CD3 v závislosti na dostupnosti) (Novocastra Laboratories Ltd). Intraepiteliální lymfocyty (IEL) na 100 enterocytů s jádry (100NE) budou počítány na 24 náhodně vybraných místech mezi špičkou klků a bází krypty (Vh/Cd) v každé biopsii. Individuální a kolektivní výsledky na tkáni odebrané po infekci měchovcem, ale při bezlepkové dietě, budou porovnány s výsledky z tkáně odebrané po provokaci těstovinami.