Инокуляция пациентов с целиакией человеческим анкилостомозом Necator Americanus: оценка иммунитета и чувствительности к глютену

Предпосылки и цели. Ряд данных свидетельствует о том, что исчезновение гельминтов среди населения развитых стран может быть причиной всплеска аутоиммунных заболеваний, так называемая гигиеническая гипотеза. Используя небольшую когорту здоровых людей с неактивной глютеновой болезнью, наша цель состоит в том, чтобы проверить, подавляет ли вездесущий анкилостомоз (HW) людей, Necator americanus, иммунную реакцию на глютеновую нагрузку (GC). Помимо потенциальной пользы для людей с непереносимостью глютена, это исследование предоставит возможность провести детальное исследование на уровне слизистых оболочек взаимодействия хозяина и паразита и лежащего в его основе иммунного ответа, а также, в более широком смысле, возможности заражения нематодами для модулировать воспалительную реакцию при ВЗК. В отличие от экспериментальных гельминтозов у ​​животных, генетически предрасположенных к колитам, или у животных с клиническими проявлениями ВЗК (где присутствует ряд осложняющих кофакторов), это исследование направлено на то, что происходит у здоровых людей, у которых не было предыстории воздействия гельминтов и которые в настоящее время не скомпрометированы. либо воспалением, либо иммунодепрессантами.

Методы: Двадцать здоровых взрослых с хорошо документированной целиакией (фенотип DQ2), соблюдающих безглютеновую (GF) диету в течение ≥ 6 месяцев (на основании анамнеза и уровня трансглютаминазы в нормальных тканях [tTG]), будут отобраны и случайным образом распределены по двум группам. группы по десять человек. Десять будут инокулированы личинками анкилостомы (HW), а 10 будут служить неинфицированным контролем. Субъекты исследования и исследователи будут ослеплены, чтобы можно было сравнить активность болезни и иммунные профили. Личинки HW будут культивироваться из фекалий, предоставленных донором-добровольцем, предварительно инфицированным для этой цели. Обычная эндоскопия и биопсия будут выполняться дважды для каждого субъекта, до и после пероральных и ректальных ГК (2x50 г ломтиков пшеничного хлеба два раза в день в течение 3-5 дней и 6 г глютена в виде 40 мл суспензии, закапываемой в прямую кишку на эндоскоп соответственно). Ректальная биопсия будет проведена через 4 часа, а биопсия двенадцатиперстной кишки будет собрана через шесть дней после GC; кровь будет собираться до и после заражения анкилостомозом и на шестой день после GC. Таким образом, для сравнения будут собраны четыре набора данных: десять субъектов с глютеновой болезнью GF до инфицирования HW; 10 ГФ с глютеновой болезнью после инфицирования HW; десять GC целиакии до инфекции HW; и 10 GC целиакии после инфекции HW.

Безопасность: Доступен большой объем данных наблюдений, подтверждающих безопасность экспериментальной инфекции анкилостомы, как наших собственных, так и исследований других. Двое из наших исследователей поддерживали инфекцию, включая случайные «добавочные» прививки, в течение трех лет без каких-либо побочных эффектов.

Показатели результатов: они будут включать: дневник симптомов субъекта, общий анализ крови, С-реактивный белок, общий и специфический IgE и активность триптазы в сыворотке. Дуоденальная (по классификации Марша) и ректальная гистология оцениваются одним патологоанатомом. Бокаловидные клетки и Т-клетки слизистой оболочки будут окрашены, чтобы облегчить количественную оценку ответов. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и лимфоциты слизистой оболочки из биоптатов кишечника будут выращивать ex vivo и заражать иммунодоминантным пептидом антигена глютена (альфа-глиадин 57-73 Q65E, QLQPFPQPELPYPQPQS). Пролиферацию клеток и профили цитокинов в ответ на HW и антигены глютена будут измерять в PBMC и биоптатах кишечника. Изменение сроков прививки может дать ценное указание на важность ответа Th2 только в том случае, если существует глубокая разница между вновь возникшими (Th2-доминантными) и зрелыми (Th-нейтральными) паразитарными инфекциями, как было предложено в нашей более ранней работе с экспериментальными инфекции человека. Уровни транскрипции представляющих интерес генов будут оцениваться с использованием количественной ПЦР в реальном времени и микрочипов.

Результаты. Нулевая гипотеза состоит в том, что Necator americanus не изменяет иммунный процесс в достаточной степени, чтобы подавить чувствительность к глютену у людей с глютеновой болезнью. Измеряемые результаты отражают активность целиакии, включая тяжесть воспаления слизистой оболочки, а также характер и интенсивность иммунных процессов. Тем не менее, это исследование касается ВЗК. Целиакия не является ВЗК, но эта модель ВЗК дает ранее неизведанную возможность протестировать квазиаутоиммунные реакции в двенадцатиперстной кишке и прямой кишке на специфический антиген, который может быть введен или исключен по требованию. Иммунное профилирование будет сосредоточено на характеристиках, которые вызывают воспаление при ВЗК, что дает четкое представление о потенциале гельминтов при болезни Крона и язвенном колите.

Расширенное исследование; Пациенты контрольной группы приглашены для участия в расширении исследования; каждый должен быть инокулирован, заражен и исследован в соответствии с исходной когортой анкилостомы (как указано выше).

Испытание низкими дозами глютена Исследование: это расширение исследования направлено на то, чтобы установить, может ли инфекция анкилостомы улучшить толерантность к небольшим количествам глютена у пациентов с глютеновой болезнью. Исследование открытое. В нем участвуют пациенты с глютеновой болезнью, уже инфицированные анкилостомозом, у которых тщательно задокументированы исходные характеристики крови и слизистых оболочек. Воздействие глютена будет применяться в дозах, которые были продемонстрированы другими в ходе испытаний как безопасные и хорошо переносимые. Эффективность заражения анкилостомами для смягчения непереносимости глютена будет измеряться количественными изменениями, которые происходят в ранее взятых биоптатах (до заражения) по сравнению с тканями, собранными после заражения. Гистология будет выполняться, как описано ранее. Биоптаты следует фиксировать в нейтральном забуференном формалине, обрабатывать, тщательно ориентировать и заключать в парафин. Срезы (3 мкм) окрашивают гематоксилином и эозином (H&E) и иммуноокрашивают анти-CD8 (или анти-CD3 в зависимости от наличия) антителами (Novocastra Laboratories Ltd). Внутриэпителиальные лимфоциты (IEL) на 100 ядерных энтероцитов (100NE) будут подсчитываться в 24 случайно выбранных участках между верхушкой ворсинок и основанием крипты (Vh/Cd) в каждой биопсии. Индивидуальные и коллективные результаты на ткани, собранной после заражения анкилостомами, но на безглютеновой диете, будут сравниваться с результатами на ткани, собранной после заражения макаронами.