Inoculare i pazienti affetti da celiachia con l'anchilostoma umano Necator Americanus: valutare l'immunità e la sensibilità al glutine

Contesto e obiettivi: una serie di prove suggerisce che la scomparsa degli elminti dalle popolazioni umane nei paesi sviluppati potrebbe essere responsabile dell'aumento delle malattie autoimmuni, la cosiddetta ipotesi igienica. Utilizzando una piccola coorte di soggetti sani con malattia celiaca quiescente, il nostro obiettivo è testare se l'onnipresente anchilostoma (HW) degli esseri umani, Necator americanus, inibisce la risposta immunitaria a una sfida del glutine (GC). Oltre ad essere di potenziale beneficio per le persone con intolleranza al glutine, questo studio offrirà l'opportunità di intraprendere un'indagine dettagliata a livello della mucosa dell'interazione ospite-parassita e della risposta immunitaria sottostante e, per estensione, del potenziale di infezione da nematodi a modulare la risposta infiammatoria nelle IBD. A differenza delle infezioni da elminti sperimentali negli animali geneticamente predisposti alla colite o nell'IBD clinica (dove sono presenti una serie di cofattori complicanti), questo studio affronta ciò che accade negli esseri umani sani che non hanno un background di esposizione all'elminto e che non sono attualmente compromessi da infiammazione o da farmaci immunosoppressori.

Metodi: Verranno reclutati venti adulti sani con celiachia ben documentata (fenotipo DQ2) conformi a una dieta priva di glutine (GF) per ≥ 6 mesi (sulla base dell'anamnesi e di una normale transglutaminasi tissutale [tTG]) e assegnati in modo casuale a due gruppi di dieci. Dieci saranno inoculate con larve di anchilostomi (HW) e 10 serviranno come controlli non infetti. I soggetti dello studio e gli investigatori saranno accecati per consentire il confronto dell'attività della malattia e dei profili immunitari. Le larve HW saranno coltivate da feci fornite da un donatore volontario, precedentemente infettato per questo scopo. L'endoscopia e la biopsia convenzionali verranno eseguite due volte per soggetto, prima e dopo GC orali e rettali (rispettivamente 2 fette da 50 g di pane di grano due volte al giorno per 3-5 giorni e 6 g di glutine in un impasto da 40 ml instillato nel retto per endoscopio). La biopsia rettale verrà effettuata 4 ore e la biopsia duodenale raccolta sei giorni dopo la GC; il sangue verrà raccolto prima e dopo l'acquisizione dell'infezione da anchilostomi e il sesto giorno successivo al GC. Pertanto, verranno accumulati quattro set di dati per il confronto: dieci soggetti celiaci GF prima dell'infezione da HW; 10 GF celiaci dopo infezione da HW; dieci GC celiaci prima dell'infezione da HW; e 10 celiaci GC dopo l'infezione da HW.

Sicurezza: è disponibile un ampio corpus di dati osservativi che documentano la sicurezza dell'infezione sperimentale da anchilostomi, sia dai nostri che da studi di altri. Due dei nostri ricercatori hanno mantenuto le infezioni, comprese occasionali inoculazioni di "ricarica" ​​per tre anni senza effetti negativi.

Misure di esito: includeranno: diario dei sintomi del soggetto, analisi del sangue completo, proteina C-reattiva, IgE totali e specifiche e attività della triptasi sierica. L'istologia duodenale (classificazione di Marsh) e rettale sarà classificata da un singolo patologo. Le cellule caliciformi e le cellule T della mucosa saranno colorate per facilitare la quantificazione delle risposte. Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e linfociti della mucosa da biopsie intestinali saranno cresciute ex vivo e sfidate con il peptide immunodominante dell'antigene del glutine (alfa-gliadina 57-73 Q65E, QLQPFPQPELPYPQPQS). Proliferazione cellulare e profili di citochine in risposta agli antigeni HW e glutine saranno misurati da PBMC e biopsie intestinali. La variazione della tempistica delle inoculazioni può fornire indicazioni valide sull'importanza della risposta Th2 solo se esiste una profonda differenza tra infezioni parassitarie di nuova costituzione (Th2-dominante) rispetto a quelle mature (Th-neutro), come suggerito dal nostro precedente lavoro con sperimentali infezioni umane. I livelli di trascrizione dei geni di interesse saranno valutati mediante PCR quantitativa in tempo reale e microarrays.

Risultati: L'ipotesi nulla è che il Necator americanus non modifichi il processo immunitario a sufficienza per sopprimere la sensibilità al glutine nelle persone con malattia celiaca. I risultati misurati riflettono l'attività della malattia celiaca, inclusa la gravità dell'infiammazione della mucosa e il carattere e l'intensità dei processi immunitari. Questo studio però riguarda tanto l'IBD. La celiachia non è IBD, ma questo modello di IBD offre un'opportunità precedentemente inesplorata per testare risposte quasi autoimmuni nel duodeno e nel retto a un antigene specifico, che può essere introdotto o escluso su richiesta. La profilazione immunitaria si concentrerà sulle caratteristiche che guidano l'infiammazione nell'IBD, fornendo una visione chiara del potenziale degli elminti nella malattia di Crohn e nella colite ulcerosa.

Studio sull'estensione; Pazienti di controllo invitati ad arruolarsi in un'estensione dello studio; ciascuno da inoculare, sfidare e indagare come per la coorte originale di anchilostomi (come sopra).

Studio di sfida al glutine a basso dosaggio: questa estensione della sperimentazione mira a stabilire se l'infezione da anchilostomi potrebbe migliorare la tolleranza a piccole quantità di glutine nei pazienti con malattia celiaca. Lo studio è aperto. Utilizza pazienti celiaci già infetti da anchilostomi e nei quali le caratteristiche basali del sangue e della mucosa sono state accuratamente documentate. L'esposizione al glutine applicherà dosi che sono state dimostrate da altri in un ambiente di prova per essere sicure e ben tollerate. L'efficacia dell'infezione da anchilostomi per mitigare l'intolleranza al glutine sarà misurata dai cambiamenti quantificabili che si verificano nelle biopsie precedentemente prelevate (pre-challenge) rispetto al tessuto raccolto post-challenge. L'istologia sarà eseguita come descritto in precedenza. Le biopsie devono essere fissate in formalina tamponata neutra, trattate e orientate con cura e incorporate nella cera di paraffina. Le sezioni (3 μm) saranno colorate con ematossilina ed eosina (H&E) e immunocolorate con anticorpi anti-CD8 (o anti-CD3 a seconda della disponibilità) (Novocastra Laboratories Ltd). I linfociti intraepiteliali (IELs) per 100 enterociti nucleati (100NE) saranno contati in 24 siti scelti a caso tra la punta del villo e la base della cripta (Vh/Cd) in ciascuna biopsia. I risultati individuali e collettivi sui tessuti raccolti dopo l'infezione da anchilostomi, ma durante una dieta priva di glutine, saranno confrontati con quelli dei tessuti raccolti dopo il test della pasta.