Inoculação de pacientes com doença celíaca com o ancilostomídeo humano Necator Americanus: avaliando a imunidade e a sensibilidade ao glúten

Justificativa e objetivos: Várias linhas de evidência sugerem que o desaparecimento de helmintos de populações humanas em países desenvolvidos pode ser responsável pelo aumento de doenças autoimunes, a chamada hipótese da higiene. Usando uma pequena coorte de indivíduos saudáveis ​​com doença celíaca quiescente, nosso objetivo é testar se o onipresente ancilostomídeo (HW) de humanos, Necator americanus, inibe a resposta imune a um desafio de glúten (GC). Além de ser um benefício potencial para pessoas com intolerância ao glúten, este estudo fornecerá a oportunidade de realizar uma investigação detalhada no nível da mucosa da interação parasita-hospedeiro e a resposta imune subjacente e, por extensão, o potencial da infecção por nematóides para modular a resposta inflamatória na DII. Ao contrário de infecções experimentais por helmintos em animais geneticamente predispostos a colite ou em IBD clínica (onde uma variedade de cofatores complicadores estão presentes), este estudo aborda o que acontece em humanos saudáveis ​​que não têm histórico de exposição a helmintos e que não estão atualmente comprometidos por inflamação ou drogas imunossupressoras.

Métodos: Vinte adultos saudáveis ​​com doença celíaca bem documentada (fenótipo DQ2) em conformidade com uma dieta livre de glúten (GF) por ≥ 6 meses (com base na história e uma transglutaminase tecidual normal [tTG]) serão recrutados e distribuídos aleatoriamente em dois grupos de dez. Dez serão inoculados com larvas de ancilostomídeos (HW) e 10 servirão como controles não infectados. Os sujeitos do estudo e os investigadores serão cegos para permitir a comparação da atividade da doença e dos perfis imunológicos. As larvas de HW serão cultivadas a partir de fezes fornecidas por um doador voluntário, previamente infectado para esse fim. Endoscopia convencional e biópsia serão realizadas duas vezes por indivíduo, antes e depois de GCs oral e retal (2x50g de fatias de pão de trigo duas vezes ao dia por 3-5 dias e 6g de glúten em uma pasta de 40ml instilada no reto por endoscópio, respectivamente). A biópsia retal será realizada 4 horas e a biópsia duodenal coletada seis dias após o GC; o sangue será coletado antes e depois de adquirir a infecção por ancilostomídeos e no sexto dia após o GC. Assim, quatro conjuntos de dados serão acumulados para comparação: dez indivíduos celíacos GF antes da infecção por HW; 10 GF celíacos após infecção por HW; dez GC celíacos antes da infecção por HW; e 10 GC celíacos após infecção por HW.

Segurança: Um grande corpo de dados observacionais documentando a segurança da infecção experimental por ancilostomídeos está disponível, tanto de nossos próprios estudos quanto de outros. Dois de nossos pesquisadores mantiveram infecções, incluindo inoculações ocasionais "de reforço", por três anos, sem efeitos nocivos.

Medidas de resultado: Incluirão: diário de sintomas do sujeito, análise de sangue completa, proteína C-reativa, IgE total e específica e atividade de triptase sérica. A histologia duodenal (classificação de Marsh) e retal será avaliada por um único patologista. Células caliciformes e células T da mucosa serão coradas para ajudar na quantificação das respostas. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e linfócitos da mucosa provenientes de biópsias intestinais serão cultivados ex vivo e desafiados com peptídeo imunodominante do antígeno do glúten (alfa-gliadina 57-73 Q65E, QLQPFPQPELPYPQPQS). Proliferação celular e perfis de citocinas em resposta aos antígenos HW e glúten serão medidos a partir de PBMCs e biópsias intestinais. Variar o tempo das inoculações pode fornecer orientações valiosas sobre a importância da resposta Th2 apenas se houver uma profunda diferença entre infecções parasitárias recém-estabelecidas (Th2-dominante) versus maduras (Th-neutra), conforme sugerido por nosso trabalho anterior com experimentos infecções humanas. Os níveis de transcrição dos genes de interesse serão avaliados por PCR quantitativo em tempo real e microarrays.

Resultados: A hipótese nula é que Necator americanus não altera suficientemente o processo imunológico para suprimir a sensibilidade ao glúten em pessoas com doença celíaca. Os resultados medidos refletem a atividade da doença celíaca, incluindo a gravidade da inflamação da mucosa e o caráter e intensidade dos processos imunológicos. Este estudo, porém, é tanto sobre IBD. A doença celíaca não é IBD, mas este modelo de IBD oferece uma oportunidade anteriormente inexplorada para testar respostas quase autoimunes no duodeno e no reto a um antígeno específico, que pode ser introduzido ou excluído sob demanda. O perfil imunológico se concentrará nas características que impulsionam a inflamação na DII, fornecendo uma visão clara do potencial dos helmintos na doença de Crohn e na colite ulcerativa.

Estudo de Extensão; Pacientes controle convidados a se inscrever em uma extensão do estudo; cada um a ser inoculado, desafiado e investigado de acordo com a coorte original de ancilostomídeos (como acima).

Estudo de provocação com baixa dose de glúten: Esta extensão do estudo procura estabelecer se a infecção por ancilostomíase pode melhorar a tolerância a pequenas quantidades de glúten em pacientes com doença celíaca. O estudo está aberto. Ele utiliza pacientes celíacos já infectados com ancilostomíase e nos quais as características basais do sangue e da mucosa foram cuidadosamente documentadas. A exposição ao glúten aplicará doses que foram demonstradas por outros em um ambiente de teste como seguras e bem toleradas. A eficácia da infecção por ancilostomídeos para mitigar a intolerância ao glúten será medida pelas alterações quantificáveis ​​que ocorrem em biópsias realizadas anteriormente (pré-desafio) em comparação com o tecido coletado após o desafio. A histologia será realizada conforme descrito anteriormente. As biópsias devem ser fixadas em formalina tamponada neutra, processadas e cuidadosamente orientadas e embebidas em parafina. Seções (3 μm) serão coradas com hematoxilina e eosina (H&E) e imunomarcadas com anticorpos anti-CD8 (ou anti-CD3 dependendo da disponibilidade) (Novocastra Laboratories Ltd). Os linfócitos intraepiteliais (IELs) por 100 enterócitos nucleados (100NE) serão contados em 24 locais selecionados aleatoriamente entre a ponta da vilosidade e a base da cripta (Vh/Cd) em cada biópsia. Resultados individuais e coletivos em tecidos coletados após infecção por ancilostomídeos, mas durante uma dieta isenta de glúten, serão comparados com aqueles de tecidos coletados após o desafio com macarrão.