Zaszczepianie pacjentów z celiakią ludzkim tęgoryjcem Necator Americanus: ocena odporności i wrażliwości na gluten

Tło i cele: Szereg dowodów sugeruje, że znikanie robaków pasożytniczych z populacji ludzkich w krajach rozwiniętych może być odpowiedzialne za gwałtowny wzrost zachorowań na choroby autoimmunologiczne, tak zwana hipoteza higieniczna. Naszym celem jest zbadanie, czy wszechobecny tęgoryjca (HW) ludzi, Necator americanus, hamuje odpowiedź immunologiczną na prowokację glutenem (GC), korzystając z niewielkiej kohorty zdrowych osób z uśpioną celiakią. Oprócz potencjalnej korzyści dla osób z nietolerancją glutenu, badanie to zapewni możliwość przeprowadzenia szczegółowych badań na poziomie błony śluzowej interakcji żywiciel-pasożyt oraz podstawowej odpowiedzi immunologicznej, a co za tym idzie, potencjalnego zakażenia nicieniami dla modulować odpowiedź zapalną w IBD. W przeciwieństwie do eksperymentalnych infekcji robakami pasożytniczymi u zwierząt genetycznie predysponowanych do zapalenia okrężnicy lub klinicznego nieswoistego zapalenia jelita grubego (gdzie występuje szereg komplikujących kofaktorów), niniejsze badanie dotyczy tego, co dzieje się u zdrowych ludzi, którzy nie mają tła narażenia na robaki i którzy nie są obecnie zagrożeni przez zapalenie lub leki immunosupresyjne.

Metody: Dwudziestu zdrowych dorosłych z dobrze udokumentowaną celiakią (fenotyp DQ2) przestrzegających diety bezglutenowej (GF) przez ≥ 6 miesięcy (na podstawie wywiadu i prawidłowej transglutaminazy tkankowej [tTG]) zostanie zrekrutowanych i losowo przydzielonych do dwóch grupy dziesięcioosobowe. Dziesięć zostanie zaszczepionych larwami tęgoryjca (HW), a 10 posłuży jako niezainfekowana kontrola. Osoby badane i badacze zostaną zaślepieni, aby umożliwić porównanie aktywności choroby i profili odpornościowych. Larwy HW będą hodowane z odchodów dostarczonych przez dobrowolnego dawcę, uprzednio zakażonego w tym celu. Konwencjonalna endoskopia i biopsja będą wykonywane dwa razy na pacjenta, przed i po GC doustnym i doodbytniczym (odpowiednio 2 x 50 g kromek chleba pszennego dwa razy dziennie przez 3-5 dni i 6 g glutenu w 40 ml zawiesiny wkraplanej do odbytnicy na endoskop). Biopsja odbytnicy zostanie przeprowadzona 4 godziny, a biopsja dwunastnicy sześć dni po GC; krew zostanie pobrana przed i po zarażeniu tęgoryjcem oraz w szóstym dniu po GC. W ten sposób do porównania zostaną zgromadzone cztery zestawy danych: dziesięciu pacjentów z celiakią GF przed zakażeniem HW; 10 celiakii GF po zakażeniu HW; dziesięć celiakii GC przed infekcją HW; i 10 celiakii GC po zakażeniu HW.

Bezpieczeństwo: Dostępny jest duży zbiór danych obserwacyjnych dokumentujących bezpieczeństwo eksperymentalnej infekcji tęgoryjcem, zarówno z naszych własnych, jak i badań przeprowadzonych przez innych. Dwóch naszych badaczy utrzymywało infekcje, w tym sporadyczne szczepienia uzupełniające przez trzy lata bez złych skutków.

Pomiary wyników: Obejmą one: dzienniczek objawów podmiotu, pełną analizę krwi, białko C-reaktywne, całkowitą i swoistą IgE oraz aktywność tryptazy w surowicy. Histologia dwunastnicy (klasyfikacja Marsha) i odbytnicy zostanie oceniona przez jednego patologa. Komórki kubkowe i limfocyty T błony śluzowej zostaną wybarwione, aby pomóc w ilościowym określeniu odpowiedzi. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i limfocyty błony śluzowej z biopsji jelit będą hodowane ex vivo i prowokowane immunodominującym peptydem antygenu glutenu (alfa-gliadyna 57-73 Q65E, QLQPFPQPELPYPQPQS). Proliferacja komórek i profile cytokin w odpowiedzi na antygeny HW i gluten będą mierzone na podstawie PBMC i biopsji jelit. Zróżnicowanie czasu szczepień może dostarczyć cennych wskazówek na temat znaczenia odpowiedzi Th2 tylko wtedy, gdy istnieje głęboka różnica między nowo ustanowionymi (dominującymi Th2) a dojrzałymi (neutralnymi Th) infekcjami pasożytniczymi, jak sugerowano w naszej wcześniejszej pracy z eksperymentalnymi infekcje u ludzi. Poziomy transkrypcji interesujących genów zostaną ocenione przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i mikromacierzy.

Wyniki: Hipotezą zerową jest to, że Necator americanus nie zmienia procesu immunologicznego w wystarczającym stopniu, aby stłumić wrażliwość na gluten u osób z celiakią. Zmierzone wyniki odzwierciedlają aktywność celiakii, w tym nasilenie zapalenia błony śluzowej oraz charakter i intensywność procesów immunologicznych. To badanie dotyczy jednak w równym stopniu IBD. Celiakia nie jest IBD, ale ten model IBD daje wcześniej niezbadaną możliwość testowania quasi-autoimmunologicznych odpowiedzi w dwunastnicy i odbytnicy na określony antygen, który można wprowadzić lub wykluczyć na żądanie. Profilowanie immunologiczne skupi się na cechach, które napędzają stan zapalny w IBD, zapewniając jasny wgląd w potencjał robaków w chorobie Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego.

badanie rozszerzone; Pacjenci z grupy kontrolnej zaproszeni do udziału w rozszerzeniu badania; każdy ma zostać zaszczepiony, poddany prowokacji i zbadany zgodnie z pierwotną kohortą tęgoryjców (jak powyżej).

Badanie prowokacyjne z niską dawką glutenu: To rozszerzenie badania ma na celu ustalenie, czy infekcja tęgoryjcem może poprawić tolerancję na niewielkie ilości glutenu u pacjentów z celiakią. Studium jest otwarte. Wykorzystuje pacjentów z celiakią już zakażonych tęgoryjcem, u których dokładnie udokumentowano wyjściową charakterystykę krwi i błony śluzowej. Ekspozycja na gluten będzie dotyczyła dawek, które zostały wykazane przez innych w warunkach próbnych jako bezpieczne i dobrze tolerowane. Skuteczność zarażenia tęgoryjcem w łagodzeniu nietolerancji glutenu będzie mierzona na podstawie wymiernych zmian zachodzących w biopsjach pobranych wcześniej (przed prowokacją) w porównaniu z tkankami pobranymi po prowokacji. Histologia zostanie przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem. Biopsje należy utrwalić w obojętnej, zbuforowanej formalinie, poddać obróbce, dokładnie ułożyć i zatopić w parafinie. Skrawki (3 µm) zostaną wybarwione hematoksyliną i eozyną (H&E) i wybarwione immunologicznie przeciwciałami anty-CD8 (lub anty-CD3 w zależności od dostępności) (Novocastra Laboratories Ltd). Limfocyty śródnabłonkowe (IEL) na 100 enterocytów jądrzastych (100NE) będą zliczane w 24 losowo wybranych miejscach między końcówką kosmków a podstawą krypty (Vh/Cd) w każdej biopsji. Indywidualne i zbiorowe wyniki na tkankach pobranych po zarażeniu tęgoryjcem, ale podczas diety bezglutenowej, zostaną porównane z wynikami z tkanek pobranych po prowokacji z makaronem.