Interakce plicní imunitní buňka-mikrobiom ve zdravých plicích (ILLUMINA-2)

Pandemie koronavirového onemocnění z roku 2019, způsobená těžkým akutním respiračním syndromem coronavirus 2, s sebou přinesla několik studií o místním plicním imunitním systému, který byl donedávna převážně terra incognita. S těmito novými metodami byly zjevně odhaleny základní aspekty plicních onemocnění, včetně plicního hyperzánětu. V současnosti je však známo velmi málo o složení normální populace imunitních buněk v lidských plicích, včetně jejich souhry s plicním mikrobiomem, tedy komenzální mikroflórou interagujících bakterií a hub, které sídlí ve zdravých plicích.

Celkový design: U 50 pacientů (25 mužů, 25 žen), intubovaných pro elektivní operaci v celkové anestezii, bude odebrán endotracheální aspirát a tekutina BAL (BALF) z jednotlivých segmentů plic. Dále bude odebrán ústní a nosní výtěr a vzorky krve. To se provede ihned po intubaci.

Z elektronického zdravotního záznamu pacienta se získá: kódy diagnózy a léky (typ a dávkování), historie kouření (současný/předchozí/nikdy nekuřák; roky balení), typ operace; kromě toho je zdravotní záznam prověřován z hlediska jakýchkoli vylučovacích kritérií

Vzorky krve se odebírají z pacientova periferního žilního katetru (zavedeného pro klinické účely) bezprostředně před odběrem BALF.

Bronchoskopie s odběrem BALF: Tento postup se provádí standardizovaným způsobem podle aktuálních klinických doporučení. Bezprostředně před výkonem se odebere ústní výtěr, nosní výtěr a endotracheální aspirát (ETA). Potom se FIO2 zvýší na 1,0 a bronchoskopický postup se provede pomocí jednorázového videoskopu o vnějším průměru 5,0 mm). Tři po sobě jdoucí 50ml alikvoty předehřátého (37 °C) izotonického fyziologického roztoku se nakapávají do mediálního segmentu pravého středního laloku, okamžitě se odsají nízkým negativním sacím tlakem (< 100 cm H2O) a spojí se do sterilní skleněné nádoby na ledu získat vzorek BALF.

Poté se provede mini-BAL v horním a dolním laloku pravé plíce s jedinou instalací 20 ml izotonického fyziologického roztoku do každého laloku s okamžitým odsátím do sterilní nádobky.

Měření: Složení populace imunitních buněk, stejně jako funkce a diferenciace různých buněčných linií bude zkoumáno sekvenováním jednobuněčné RNA (scRNA-seq) na vybraných imunitních buňkách z BALF, ETA a krve. být doplněny o hromadné sekvenování RNA s čárovým kódováním vzorků a multiplexováním, což poskytuje podrobný expresní vzor všech vzorků.

Složení mikrobiomu v BALF, ETA a ústních stěrech bude hodnoceno cíleným amplikonovým sekvenováním hypervariabilních oblastí 1 až 3 podjednotky 16S genu ribozomální RNA pro bakterie.

Statistické analýzy: budou provedeny pomocí statistického softwaru R verze 4.1.1 (R Project for Statistical Computing) v rámci statistického softwaru RStudio verze 1.4.1717 (RStudio) a p<0,05 považovány za statisticky významné. Kontrola homogenity normality a rozptylu bude provedena vytvořením qq grafů a histogramů. Budou použity statistické inferenční nástroje SPIEC-EASI a HeatMaps a na základě korelačních analýz budou k identifikaci znaků použity analýzy hlavních komponent, včetně nehierarchální shlukové analýzy.