Interacciones entre células inmunitarias pulmonares y microbioma en el pulmón sano (ILLUMINA-2)

La pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019, causada por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2, ha traído consigo varios estudios sobre el sistema inmunitario pulmonar local, que hasta hace muy poco era en gran parte una terra incógnita. Con estos nuevos métodos se han descubierto aspectos aparentemente fundamentales de la enfermedad pulmonar, entre ellos la hiperinflamación pulmonar. Sin embargo, actualmente se sabe muy poco sobre la composición de la población de células inmunitarias normales en el pulmón humano, incluida su interacción con el microbioma pulmonar, es decir, la microbiota comensal de bacterias y hongos que interactúan y residen dentro del pulmón sano.

Diseño general: en 50 pacientes (25 hombres, 25 mujeres), intubados para cirugía electiva en anestesia general, se obtendrá un aspirado endotraqueal y líquido BAL (BALF) de segmentos pulmonares separados. Además, se recogerá un hisopo oral y nasal y muestras de sangre. Esto se hará inmediatamente después de la intubación.

De la historia clínica electrónica del paciente se obtiene: códigos de diagnóstico y medicación (tipo y dosis), historial de tabaquismo (actual/anterior/nunca fumador; paquete años), tipo de operación; además, se examina la historia clínica en busca de cualquier criterio de exclusión

Las muestras de sangre se extraen del catéter venoso periférico del paciente (insertado con fines clínicos) inmediatamente antes de la recolección de BALF.

Broncoscopia con colección BALF: Este procedimiento se realiza de forma estandarizada según las guías clínicas vigentes. Inmediatamente antes del procedimiento, se obtienen un hisopo oral, un hisopo nasal y un aspirado endotraqueal (ETA). A continuación, se aumenta la FIO2 a 1,0 y se realiza el procedimiento de broncoscopia utilizando un videoscopio desechable con un diámetro exterior de 5,0 mm). Se instilan tres alícuotas sucesivas de 50 ml de solución salina isotónica precalentada (37 °C) en el segmento medial del lóbulo medio derecho, se aspiran inmediatamente con una presión de succión negativa baja (< 100 cm H2O) y se agrupan en un recipiente de vidrio estéril en hielo. para obtener una muestra BALF.

Posteriormente se realiza un mini-BAL en el lóbulo superior e inferior del pulmón derecho con una única instalación de 20 ml de solución salina isotónica en cada lóbulo con aspiración inmediata a un recipiente estéril.

Mediciones: la composición de la población de células inmunitarias, así como la función y la diferenciación de varias líneas celulares se investigarán mediante secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) en células inmunitarias seleccionadas de BALF, ETA y sangre, y esto complementarse con secuenciación de ARN a granel con códigos de barras de muestras y multiplexación, lo que proporciona un patrón de expresión detallado de todas las muestras.

La composición del microbioma en BALF, ETA y hisopos orales se evaluará mediante la secuenciación de amplicones específicos de las regiones hipervariables 1 a 3 de la subunidad 16S del gen del ARN ribosomal para bacterias.

Análisis estadísticos: se realizarán utilizando el software estadístico R versión 4.1.1 (R Project for Statistical Computing) dentro del software estadístico RStudio versión 1.4.1717 (RStudio), y p<0,05 considerado estadísticamente significativo. La inspección de la normalidad y la homogeneidad de la varianza se realizará mediante la creación de diagramas qq e histogramas. Se utilizarán las herramientas de inferencia estadística SPIEC-EASI y HeatMaps y, basándose en análisis correlacionales, se aplicarán análisis de componentes principales, incluido el análisis de conglomerados no jerárquico, para identificar rasgos.