Interações do microbioma da célula imune pulmonar no pulmão saudável (ILLUMINA-2)

A pandemia da doença de coronavírus 2019, causada pelo coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave, trouxe consigo vários estudos sobre o sistema imunológico pulmonar local, que até muito recentemente era uma terra incógnita. Com esses novos métodos, aspectos aparentemente fundamentais da doença pulmonar foram descobertos, incluindo a hiperinflamação pulmonar. No entanto, muito pouco se sabe atualmente sobre a composição da população normal de células imunes no pulmão humano, incluindo sua interação com o microbioma pulmonar, ou seja, a microbiota comensal de bactérias e fungos interativos que residem no pulmão saudável.

Projeto geral: Em 50 pacientes (25 homens, 25 mulheres), intubados para cirurgia eletiva em anestesia geral, um aspirado endotraqueal e líquido BAL (BALF) de segmentos pulmonares separados serão obtidos. Além disso, um swab oral e nasal e amostras de sangue serão coletados. Isso será feito imediatamente após a intubação.

Do prontuário eletrônico do paciente são obtidos: códigos de diagnóstico e medicação (tipo e dosagem), história tabágica (atual/anterior/nunca fumante; maços anos), tipo de operação; além disso, o registro de saúde é rastreado para quaisquer critérios de exclusão

As amostras de sangue são retiradas do cateter venoso periférico do paciente (inserido para fins clínicos) imediatamente antes da coleta do BALF.

Broncoscopia com coleta de BALF: Este procedimento é realizado de forma padronizada de acordo com as diretrizes clínicas atuais. Imediatamente antes do procedimento, são obtidos um swab oral, um swab nasal e um aspirado endotraqueal (ETA). A FIO2 é então aumentada para 1,0 e o procedimento de broncoscopia é realizado usando um videoscópio descartável com diâmetro externo de 5,0 mm). Três alíquotas sucessivas de 50 ml de solução salina isotônica pré-aquecida (37°C) são instiladas no segmento medial do lobo médio direito, aspiradas imediatamente com baixa pressão de sucção negativa (< 100 cm H2O) e reunidas em um recipiente de vidro estéril no gelo para obter uma amostra BALF.

Em seguida é realizado um mini-BAL no lobo superior e inferior do pulmão direito com instalação única de 20 ml de soro fisiológico isotônico em cada lobo com aspiração imediata para recipiente estéril.

Medições: A composição da população de células imunes, bem como a função e diferenciação de várias linhagens celulares serão investigadas por sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) em células imunes selecionadas de BALF, ETA e sangue, e isso irá ser complementado por sequenciamento de RNA em massa com código de barras de amostra e multiplexação, fornecendo um padrão de expressão detalhado de todas as amostras.

A composição do microbioma em BALF, ETA e swabs orais será avaliada por sequenciamento de amplicon direcionado das regiões hipervariáveis ​​1 a 3 da subunidade 16S do gene de RNA ribossômico para bactérias.

Análises estatísticas: serão realizadas com o software estatístico R versão 4.1.1 (R Project for Statistical Computing) dentro do software estatístico RStudio versão 1.4.1717 (RStudio), e p<0,05 considerado estatisticamente significativo. A inspeção da normalidade e da homogeneidade da variância será feita por meio da criação de qq-plots e histogramas. Serão utilizadas as ferramentas de inferência estatística SPIEC-EASI e HeatMaps e, a partir de análises correlacionais, análises de componentes principais, incluindo análise não hierárquica de agrupamentos, serão aplicadas para identificação de traços.