Keuhkojen immuunisolu-mikrobiomivuorovaikutukset terveissä keuhkoissa (ILLUMINA-2)

Vakavan akuutin hengitystieoireyhtymän koronavirus 2:n aiheuttama koronavirustauti 2019 -pandemia on tuonut mukanaan useita tutkimuksia paikallisesta keuhkojen immuunijärjestelmästä, joka oli vielä aivan viime aikoihin pitkälti terra incognita. Näillä uusilla menetelmillä on paljastettu keuhkosairauden ilmeisen perustavanlaatuisia piirteitä, mukaan lukien keuhkojen liikatulehdus. Tällä hetkellä tiedetään kuitenkin hyvin vähän ihmisen keuhkojen normaalin immuunisolupopulaation koostumuksesta, mukaan lukien sen vuorovaikutus keuhkojen mikrobiomin kanssa, eli terveissä keuhkoissa olevien vuorovaikutuksessa olevien bakteerien ja sienten kommensaalista mikrobiotasta.

Kokonaissuunnitelma: 50 potilaasta (25 miestä, 25 naista), jotka on intuboitu elektiiviseen leikkaukseen yleisanestesiassa, otetaan endotrakeaalinen aspiraatti ja BAL-neste (BALF) erillisistä keuhkosegmenteistä. Lisäksi otetaan suu- ja nenänäytteitä sekä verinäytteitä. Tämä tehdään välittömästi intuboinnin jälkeen.

Potilaan sähköisestä terveyskertomuksesta saadaan seuraavat tiedot: diagnoosikoodit ja lääkitys (tyyppi ja annostus), tupakointihistoria (nykyinen/edellinen/ei koskaan tupakoinut; pakkausvuodet), leikkauksen tyyppi; Lisäksi terveyskertomus seulotaan mahdollisten poissulkemiskriteerien varalta

Verinäytteet otetaan potilaan ääreislaskimokatetrista (asetettu kliinisiä tarkoituksia varten) välittömästi ennen BALF-keräystä.

Bronkoskopia BALF-kokoelmalla: Tämä toimenpide suoritetaan standardoidulla tavalla nykyisten kliinisten ohjeiden mukaisesti. Välittömästi ennen toimenpidettä otetaan vanupuikko suun kautta, nenäpuikko ja endotrakeaalinen aspiraatti (ETA). FIO2 nostetaan sitten arvoon 1,0, ja bronkoskoopia suoritetaan käyttämällä kertakäyttöistä videoskooppia, jonka ulkohalkaisija on 5,0 mm). Kolme peräkkäistä 50 ml:n alikvoottia esilämmitettyä (37 °C) isotonista suolaliuosta tiputetaan oikean keskilohkon mediaaliseen segmenttiin, imetään välittömästi pienellä negatiivisella imupaineella (< 100 cm H2O) ja yhdistetään steriiliin lasiastiaan jäillä. saadaksesi BALF-näytteen.

Myöhemmin mini-BAL suoritetaan oikean keuhkon ylä- ja alalohkoon lisäämällä 20 ml isotonista suolaliuosta jokaiseen keuhkoon ja imemällä se välittömästi steriiliin säiliöön.

Mittaukset: Immuunisolupopulaation koostumusta sekä eri solulinjojen toimintaa ja erilaistumista tutkitaan yksisoluisella RNA-sekvensoinnilla (scRNA-seq) valituista immuunisoluista BALF:sta, ETA:sta ja verestä, ja tämä täydennetään joukko-RNA-sekvensoinnilla näyteviivakoodauksella ja multipleksoinnilla, jolloin saadaan yksityiskohtainen ilmentymiskuvio kaikista näytteistä.

Koostumuksen mikrobiomi BALF-, ETA- ja suupyyhkäisyissä arvioidaan bakteerien ribosomaalisen RNA-geenin 16S-alayksikön hypervariaabelien alueiden 1-3 kohdistetulla amplikonisekvensoinnilla.

Tilastolliset analyysit: suoritetaan R-tilastoohjelmiston versiolla 4.1.1 (R Project for Statistical Computing) RStudio tilastoohjelmiston versiossa 1.4.1717 (RStudio), ja p < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi. Normaalin ja varianssin homogeenisuuden tarkastaminen tehdään luomalla qq-kaavioita ja histogrammeja. Tilastollisia päättelytyökaluja SPIEC-EASI ja HeatMaps käytetään, ja korrelaatioanalyysien perusteella ominaisuuksien tunnistamiseen sovelletaan pääkomponenttianalyysejä, mukaan lukien ei-hierarkkinen klusterianalyysi.