Interakcje między komórkami odpornościowymi płuc a mikrobiomem w zdrowym płucu (ILLUMINA-2)

Pandemia choroby koronawirusowej 2019, wywołana przez koronawirusa 2 zespołu ostrej niewydolności oddechowej, przyniosła ze sobą kilka badań dotyczących lokalnego układu odpornościowego płuc, który do niedawna był w dużej mierze terra incognita. Dzięki tym nowym metodom odkryto pozornie fundamentalne aspekty chorób płuc, w tym hiperzapalenie płuc. Jednak obecnie bardzo niewiele wiadomo na temat składu normalnej populacji komórek odpornościowych w ludzkich płucach, w tym jej interakcji z mikrobiomem płucnym, czyli mikrobiomem komensalnym wchodzących w interakcje bakterii i grzybów, które znajdują się w zdrowym płucu

Ogólny projekt: U 50 pacjentów (25 mężczyzn, 25 kobiet) zaintubowanych do planowego zabiegu w znieczuleniu ogólnym zostanie pobrana aspirat z tchawicy i płyn BAL (BALF) z oddzielnych segmentów płuca. Ponadto zostanie pobrany wymaz z jamy ustnej i nosa oraz próbki krwi. Zostanie to zrobione natychmiast po intubacji.

Z elektronicznej dokumentacji medycznej pacjenta uzyskuje się: kody diagnostyczne i leki (rodzaj i dawkowanie), historię palenia (obecny/poprzedni/nigdy niepalący; paczkomaty), rodzaj operacji; ponadto dokumentacja medyczna jest sprawdzana pod kątem wszelkich kryteriów wykluczenia

Próbki krwi pobierane są z cewnika do żyły obwodowej pacjenta (wprowadzonego do celów klinicznych) bezpośrednio przed pobraniem BALF.

Bronchoskopia z pobraniem BALF: Ta procedura jest wykonywana w sposób wystandaryzowany zgodnie z aktualnymi wytycznymi klinicznymi. Bezpośrednio przed zabiegiem pobierany jest wymaz z jamy ustnej, nosa oraz aspirat z tchawicy (ETA). Następnie zwiększa się FIO2 do 1,0 i wykonuje się zabieg bronchoskopii przy użyciu wideoskopu jednorazowego użytku o średnicy zewnętrznej 5,0 mm). Trzy kolejne 50-ml podwielokrotności wstępnie ogrzanej (37°C) izotonicznej soli fizjologicznej wkrapla się do przyśrodkowego odcinka prawego środkowego płata, natychmiast odsysa przy niskim ujemnym ciśnieniu ssania (< 100 cm H2O) i umieszcza w sterylnym szklanym pojemniku na lodzie aby uzyskać próbkę BALF.

Następnie wykonuje się mini-BAL w górnym i dolnym płacie prawego płuca z jednorazową instalacją 20 ml izotonicznej soli fizjologicznej w każdym płacie z natychmiastową aspiracją do sterylnego pojemnika.

Pomiary: Skład populacji komórek odpornościowych, a także funkcja i różnicowanie różnych linii komórkowych zostaną zbadane za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) na wybranych komórkach odpornościowych z BALF, ETA i krwi, co pozwoli być uzupełnione przez masowe sekwencjonowanie RNA z kodami kreskowymi próbek i multipleksowaniem, co daje szczegółowy wzór ekspresji wszystkich próbek.

Skład mikrobiomu BALF, ETA i wymazów z jamy ustnej zostanie oceniony przez ukierunkowane sekwencjonowanie amplikonów regionów hiperzmiennych od 1 do 3 podjednostki 16S rybosomalnego genu RNA dla bakterii.

Analizy statystyczne: będą wykonywane przy użyciu oprogramowania statystycznego R w wersji 4.1.1 (R Project for Statistical Computing) w oprogramowaniu statystycznym RStudio w wersji 1.4.1717 (RStudio), a p<0,05 uznano za statystycznie istotne. Kontrola normalności i jednorodności wariancji zostanie przeprowadzona poprzez utworzenie wykresów qq i histogramów. Wykorzystane zostaną narzędzia do wnioskowania statystycznego SPIEC-EASI i HeatMaps, aw oparciu o analizy korelacyjne zostaną zastosowane analizy głównych składowych, w tym niehierarchiczna analiza skupień, w celu identyfikacji cech.