Neue Rolle von NOTCH-bezogenen langen nichtkodierenden RNA(s) als Biomarker in der Flüssigbiopsie von Patienten mit Darmkrebs

1. EINLEITUNG Hintergrund: Darmkrebs (CRC) gilt aufgrund seiner hohen Inzidenz- und Mortalitätsraten als ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit (1). Im Jahr 2020 war CRC nach Brust- und Lungenkrebs die dritthäufigste bösartige Erkrankung, machte 10 % der Neuerkrankungen aus und lag mit 9,4 % der Todesfälle an zweiter Stelle in Bezug auf die Mortalität (2). Leider wird bis zum Jahr 2030 weltweit mit mehr als 2,2 Millionen Neuerkrankungen und 1,1 Millionen Todesfällen durch Darmkrebs gerechnet (3).

Problem: Trotz erheblicher Verbesserungen bei chirurgischen oder radiologischen interventionellen Behandlungsansätzen bei CRC durch neoadjuvante Therapien bleibt die Prognose der Patienten düster (4,5). Metastasen und postoperative Tumorrezidive treten häufig auf, insbesondere bei fortgeschritteneren Krebsfällen (6), was möglicherweise für die erhöhte Anzahl von Fällen und die Prognose von Todesfällen verantwortlich ist und den nationalen Bemühungen zur Umsetzung der SDGs der Egypt Vision 2030 zuwiderläuft.

Problemstellung: Herkömmlich verwendete CRC-Prognosemarker zur Überwachung des Behandlungsergebnisses und zum Hinweis auf ein erneutes Auftreten von Krebs sind Kohlenhydratantigen 19,9 (CA19,9). und/oder karzinoembryonales Antigen (CEA), die für eine effizientere und frühere Prognose nicht so empfindlich (7) sind, je nach Subklassifizierung oder Stratifizierung des Patienten im Zusammenhang mit pathologischen CRC-Merkmalen. Daher besteht eine wachsende Nachfrage nach empfindlichen und präzisen biomolekularen Markern, die besser mit CRC-Prognosemarkern und/oder dem klinischen CRC-Ergebnis korrelieren (8), d. h. im Erfolgsfall die Grundlage für „Bessere Gesundheit“ SDG Nr. 3 und weniger bilden würden Krebsrezidive und damit eine geringere Sterblichkeit.

Flüssigbiopsien werden für die Diagnose oder Prognose von Krebserkrankungen wie Brustkrebs, Leukämie, Leberkrebs oder Darmkrebs verwendet, und zwar durch Messung von Tumor-abgeleiteten biomolekularen Markern, einschließlich zirkulierender ncRNAs, einschließlich langer nichtkodierender RNAs (lncRNAs), microRNA, exosomaler ncRNAs und Onkogene oder Tumorsuppressorgene und deren Mutationen, tumorbezogene Zytokine und nachgeschaltete Zielproteine ​​(9-22).

Nach umfangreicher Literaturrecherche und Recherche zur Schließung von Forschungslücken für eine bessere „Krebs-Epigenetik-Studie; ein Schritt in Richtung ncRNA-Präzision“ haben wir in der aktuellen Arbeit zwei Notch-verwandte lncRNAs ausgewählt, um sie in Relation zu untersuchen -zu-CRC-Prognose.

Der Notch-Signalweg ist eine innerhalb einer Spezies allgegenwärtige Kaskade zur Steuerung einer Vielzahl biologischer Ereignisse, einschließlich Zellteilung, Proliferation und Zelltod (23,24). Jüngste Untersuchungen haben die grundlegende Rolle der Notch-Kaskade bei der CRC-Entwicklung aufgezeigt (25). Sowohl die homöostatische Selbsterneuerung als auch die tumorfördernde Transformation der Darmepithelzellen können durch Notch-Signale gesteuert werden (26). Die Stimulation der Notch-Kaskade kann epigenetisch durch fehlregulierte Expressionen nicht-proteinkodierender RNAs (ncRNAs) ausgelöst werden (27); Heutzutage ist es ein wichtiges Forschungsgebiet, um den Einfluss von Notch-verwandten ncRNAs auf das CRC-Risiko und/oder die CRC-Progression herauszufinden.

Der signifikante Nutzen von Tumor-exprimierten Notch-assoziierten lncRNAs als prognostische Malignitätsindikatoren beweist, wie sie mit Karzinogenese oder Metastasierung verbunden sind und daher die Ergebnisse bei verschiedenen Krebsarten, einschließlich CRC, widerspiegeln (28-31).

Small Nucleolar RNA Host Gene3 (SNHG3) ist eine 4950 bp große lncRNA, die sich auf Chromosom 1p35.3 befindet (32). Bei Brustkrebs löst hochreguliertes SNHG3 aufgrund seiner kompetitiven Bindung an die Mikro-RNA (miR) hsa-miR-154-3p des menschlichen Homo sapiens (hsa) die Aktivierung des Notch-Systems aus, was die Proliferation und Metastasierung von Krebszellen beschleunigt (33). Darüber hinaus reguliert SNHG3 die Notch1-Expression bei Eierstockkrebs durch die Unterdrückung von hsa-miR-139-5p positiv und beschleunigt so die Proliferation und Migration von Tumorzellen (34). SNHG3 übte eine krebserregende Rolle bei Prostatakrebs, Osteosarkom, Gliom, Magenkrebs, Kehlkopfkrebs, Blasenkrebs und Darmkrebs aus (32). Huang et al. berichteten, dass SNHG3 die Expression in CRC-Zellen und -Geweben erhöhte und das Fortschreiten des Krebses durch Schwämmen von hsa-miR-182-5p stimulierte (35). Daher gilt SNHG3 als Malignitätsverstärker, der das Notch-System bei verschiedenen Krebsarten reguliert.

Leukämie-assoziierter NC-Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor1-Rezeptor (IGF1R)-Aktivator-RNA1 (LUNAR1) dient als Downstream-Ziel der Notch-Signalisierung, gleichzeitig wirkt LUNAR1 durch Notch-Signalstimulation. LUNAR1 ist ein Transkript des 491 Nukleotide (nt)-Gens auf Chromosom 15q26.3 mit vier Exons und Poly(A)-Schwanz (36). Es wurde festgestellt, dass LUNAR1 in CRC-Geweben erhöht ist, ausgelöst durch die Notch1-Stimulation, was das Fortschreiten des CRC durch Beibehaltung der IGF1R-Expression beschleunigt (37) und ein positiver Regulator der Zellteilung ist. Ziel der Studie: Per, wenige Forschungspublikationen zu beiden Notch-bezogenen lncRNAs, SNHG3 und LUNAR1 werden bei der CRC-Prognose oder der CRC-Risikobewertung sowie bei der Patientenstratifizierung auf der Grundlage klinisch-pathologischer Merkmale berücksichtigt. Daher ist die Bewertung des klinischen Nutzens der Fold-Change-Expression von SNHG3- und LUNAR1-lncRNAs bei der Flüssigbiopsie des peripheren Bluts von CRC-Patienten alarmierend ( als Schritt zur Implementierung der ncRNA-Präzision) Studienziel(e): Erstens: Bewertung des Expressionsniveaus und -musters der Notch-assoziierten lncRNAs SNHG3 und LUNAR1 in der peripheren Blutflüssigkeitsbiopsie, befragt aus der Kohorte behandlungsnaiver ägyptischer CRC-Patienten im Vergleich zum Alter -passende und geschlechtsangepasste, scheinbar gesunde freiwillige Probanden als Kontrollen. Zweitens soll der Nutzen der lncRNAs SNHG3- und LUNAR1-Expression als empfindliche, nicht-invasive prognostische biomolekulare Marker für die CRC-Überwachung bewertet werden. Drittens soll die Korrelation zwischen der SNHG3- und LUNAR1-Expression mit klinisch-pathologischen CRC-Merkmalen untersucht werden. Abschließend soll die Relevanz der untersuchten lncRNAs für die Bewertung der klinischen Merkmale von CRC-Patienten untersucht werden. Alle diese Ziele müssen durch In-silico-Analyse und Bioinformatik-Datenbanken bestätigt oder ausgeschlossen werden. THEMEN 2.1. Stichprobengröße und Aussagekraft der Studie. In Übereinstimmung mit früheren Referenzstudien (36,38) wurde die Stichprobengröße mithilfe des Online-Rechners für die Stichprobengröße https://riskcalc.org/samplesize/# geschätzt. zum Vergleich der Fläche unter der Kurve (AUC) mit einem Nullhypothesewert (durchgeführt im Januar 2021) unter Verwendung des zweiseitigen Signifikanzniveaus von 0,05 und der Potenz (1-Beta) von 0,95 als zweiseitiges Konfidenzniveau von 95 %. Die Gruppen bestehen aus 45 Proben für CRC-Patienten und 17 Kontrollen für SNHG3 und 48 CRC-Patienten gegenüber 16 Kontrollen für LUNAR1.

2.2. Studiendesign. Fallkontrollierte, retrospektive Beobachtungsstudie. Die Studie wurde von Juni 2021 bis Oktober 2022 durchgeführt.

2.3. Erklärung des Institutional Review Board (IRB): Diese Studie wurde ethisch vom Review Board Research Ethical Committee (REC) der Fakultät für Pharmazie der Ain Shams University (REC ID 15, 2021) genehmigt, das wiederum von der Fakultät für Medizin der Ain Shams University genehmigt wurde Krankenhäuser, Ain Shams University REC. Diese Forschungsuntersuchung wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration der Helsinki-Grundsätze und der Deklaration der Weltärztekammer von Helsinki: Ethische Grundsätze für die medizinische Forschung an menschlichen Probanden, 2013, durchgeführt. Jeder freiwillige Teilnehmer der Studie, ob scheinbar gesunde Kontrollpersonen oder CRC-Patienten, war sich des Ziels der Studie voll bewusst und unterzeichnete ein schriftliches Formular mit umfassender Einverständniserklärung (I.C.), das ethisch genehmigt wurde.

2.4. Studienteilnehmer 2.4.1. Patientengruppe. 70 ägyptische CRC-Patienten, die vor einer chirurgischen Behandlung oder einer neoadjuvanten CRC-Behandlung in das Onkologiezentrum der medizinischen Fakultät des Ain Shams University Hospitals (ASUH) oder in die Abteilung für onkologische Chirurgie des Dar-El-Shafa-Krankenhauses aufgenommen wurden, sofern sie dafür geeignet waren und der Teilnahme zugestimmt (das I.C unterzeichnet) wurden für die Forschung rekrutiert. Das Verhältnis von Mann zu Frau betrug 30:40 mit einer Altersspanne; Minimum-Maximum 24 -79 Jahre.

2.4.2. Scheinbar gesunde Kontrollgruppe. Als Kontrollgruppe dienten 26 zufällig ausgewählte, alters- und geschlechtsangepasste gesunde Probanden. Das Verhältnis von Mann zu Frau betrug 9:17 und die Altersspanne variierte; Minimum-Maximum 35 -78 Jahre. Die Probanden der Kontrollgruppe wurden aus denjenigen ausgewählt, die Krankenhauspersonal im Krankenhaus besuchten, oder aus Blutspendern der ASUH-Blutspendeeinheit. Keiner der Kontrollgruppe nahm Medikamente ein oder litt an Krankheiten, als der Fragesteller Blutproben für das Blutbild nahm.

2.4.3. Einschluss- und Ausschlusskriterien: Patienten, die in das Onkologiezentrum der ASUH oder in die Abteilung für onkologische Chirurgie des Dar-El-Shafa-Krankenhauses kamen und bei denen eine Reihe von Dickdarmsymptomen auftraten, wie Verstopfung, Bauchbeschwerden, rektale Blutungen und plötzlicher Gewichtsverlust, wurden eingeschlossen in der Studie, als die Diagnose von Darmkrebs durch Röntgenaufnahmen des Abdomens, Koloskopie und Histopathologie klinisch bestätigt wurde.

Ausschlusskriterien: Patienten, die eine Chemotherapie, Strahlentherapie oder eine Operation erhielten. Patienten mit anderen Krebsarten wurden ebenfalls ausgeschlossen. Personen mit fehlenden Daten wurden nicht berücksichtigt.

2.4.4. Pathologische und klinische Daten der Patienten Für jeden CRC-Teilnehmer wurden die Ergebnisse der Koloskopie, der Röntgenbildgebung des Abdomens und der pathologischen Auswertungen zur Definition des CRC-Stadiums herangezogen. Die Stadieneinstufung der Tumorlymphknotenmetastasierung (TNM) basierte auf dem Kriterium des American Joint Committee on Cancer (AJCC) (39).

Die Familiengeschichte der CRC-Studienteilnehmer, Bluthochdruck (HTN) oder Diabetes mellitus (DM) wurden als nicht übertragbare Krankheiten (NCD) erfasst, um sie mit den untersuchten Notch-bezogenen lncRNAs zu korrelieren.

Entzündliche Erkrankungen wie Colitis ulcerosa, Tumorgröße, Tumorlokalisation, ob rektal, kolonisch oder rektosigmoid, ob es sich um einen schleimigen Tumor handelt oder nicht, Tiefe der Tumorinvasion, Lymphknotenmetastasierung (LNM), Vorliegen einer Gefäßinvasion oder nicht, Status der Tumordifferenzierung; Adenokarzinom, mäßig differenziertes Adenokarzinom oder schlecht differenziertes Adenokarzinom sowie das Vorhandensein der subhistologischen Merkmale, Siegelringzelle oder nicht, wurden aus den Akten geeigneter freiwilliger CRC-Patienten gesammelt.

3. Methoden 3.1. In-Silico-Analyse 3.1.1. Notch-bezogene lncRNA-Bioinformatik aus verschiedenen Datenbanken über (abgerufen im Januar 2021 und überarbeitet im Juli 2023) Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) (40) mit ClusterProfiler unter Verwendung der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (41,42) von Genome net https://www.genome.jp/ wurde verwendet, um die funktionelle Anreicherung von Genen, Krankheiten, Netzwerken, Medikamenten und Signalwegen im Zusammenhang mit der Notch-Signalisierung zu analysieren. Ensemble-Datenbanksuche (43) https://www.ensembl.org/index.html für die potenziell wahrscheinlichen Notch-bezogenen lncRNAs SNHG3- und LUNAR1-Gene National Center for Biotechnology Information (NCBI) https://www.ncbi.nlm.nih .gov/ Suche nach Charakterisierung der untersuchten hsa lncRNAs SNHG3-Gen und Transkripte (2) und hsa lncRNAs LUNAR1-Gen und Transkript (1). HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) (44) https://www.genenames.org/ hsa lncRNAs-Gene SNHG3 und LUNAR1.

3.1.2. LncRNADisease v3.0 Expression LncRNA and Disease Database (Version 3.0) (45) zur Untersuchung der Notch-bezogenen lncRNAs-Expression CRC, die aus validierten experimentellen Ergebnissen in Veröffentlichungen abgerufen oder vorhergesagt wurde http://www.rnanut.net/lncrnadisease/index.php/ Startseite 3.1.3. Expression von lncRNA oder Genen bei 32 Krebsarten über die ENCORI Project Pan-Cancer Analysis Platform (46) https://rnasysu.com/encori/panGeneDiffExp.php. Die Expressions-Boxplot-Werte von Genen aus RNA-seq-Daten wurden mit log2(FPKM + 0,01) skaliert, während diejenigen aus miRNA-seq-Daten mit log2(RPM + 0,01) skaliert wurden. Differenzielle Expressionsanalyse für SNHG3, LUNAR1 und seine Transkript-IGF1R-Expressionsniveaus in CRC-Tumorproben im Vergleich zu Kontrollproben.

3.1.4. Funktionelle Anreicherungsanalyse und gezielte Signalwege KEGG Targeted Pathways und STRING Protein-Protein Interaction (PPI)-Netzwerke Version 11.5 https://string-db.org/ (47,48) (Zugriff im Juli 2023).

LncRNAWiki 2.0 LncRNA - LncRNAWiki - CNCB-NGDChttps://ngdc.cncb.ac.cn/lncrnawiki/ (Zugriff am 30. August 2023) 3.2. Blutproben Von CRC-Patienten und gesunden Freiwilligen wurden fünf Milliliter periphere venöse Blutflüssigkeitsbiopsie entnommen und in gerinnungsaktivierenden Polymergel-Vakutainern (Greiner Bio-One GmbH, Australien) aufbewahrt. Die Proben wurden in Vacutainern bei einer Geschwindigkeit von 4000 U/min zehn Minuten lang bei Raumtemperatur (25 °C) zentrifugiert. Das erhaltene Serum wurde aliquotiert und bei -80 °C in RNAse-freien Eppendorf-Röhrchen gelagert.

3.2.1. Gesamt-RNA-Extraktion mit dem miRNeasy Mini-Kit (Kat. Nr. 217004; Qiagen, Hilden, Deutschland) wurde Gesamt-RNA gemäß den Anweisungen des Protokolls aus Seren isoliert. Aliquote der extrahierten RNA wurden nach dem Auflösen in 30 μl RNase-freiem Wasser bei –80 °C aufbewahrt.

3.2.2. Quantifizierung der gereinigten RNA Mit einem NanoDrop®-1000-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) werden die Reinheit und Konzentration der isolierten RNA bewertet. Die RNA-Menge in der Probe wurde unter Verwendung der Absorption bei 260 nm (A260 = 1 → 44 ng/μl) bestimmt. Darüber hinaus wurde die Reinheit der RNA anhand des Verhältnisses A260/280 nm bewertet. Das akzeptable Verhältnis 260/280 liegt zwischen 1,8 und 2,1, während das Verhältnis 260/230 mehr als 1,7 beträgt.

3.2.3. Die Synthese komplementärer DNA (cDNA) für Reverse Transkription wurde mit dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit mit RNase-Inhibitor (Kat. Nr. 4374966, Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, USA) gemäß den Herstellervorschriften. In einem Reaktionsvolumen von 20 µl wurde die reverse Transkription 10 Minuten lang bei 25 °C und 120 Minuten lang bei 37 °C durchgeführt und anschließend 5 Minuten lang bei 85 °C hitzeinaktiviert. Die produzierte cDNA wurde bis zu weiteren Untersuchungen bei -80 °C aufbewahrt.

3.2.4. Expressionsmessung von lncRNAs mittels quantitativer Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) QRT-PCR wurde in einer 20-µl-Reaktion unter Verwendung des TaqMan® Gene Expression Master Mix (Kat. Nr. 4370048, Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, USA). Um die Expressionsniveaus der lncRNAs SNHG3 und LUNAR1 zu bestimmen, werden TaqMan-Genexpressionstests für menschliches SNHG3 (Hs05055352_s1, Kat. Nr. 4448892, ThermoFisher Scientific, USA) und menschliches LUNAR1 (Hs03829521_s1, Kat. Nr. 4426961, ThermoFisher Scientific, USA) und der TaqMan-Genexpressionstest für humane Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) (Kat. 4326317E, ThermoFisher Scientific, USA) wurde als endogener Standard zur Normalisierung der Werte verwendet. Die Reaktion wurde unter Verwendung der StepOne™ qRT-PCR-Technik (Applied Biosystems, CA, USA) durchgeführt. Die Temperaturzyklusstrategie war wie folgt: eine Phase der anfänglichen Uracil-N-Glycosylase (UNG)-Inkubation bei 50 °C für 2 Minuten, gefolgt von einem 10-minütigen Aktivierungsschritt bei 95 °C, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen für 15 Sekunden bei 95 °C, Glühen und Strecken für 1 Minute bei 60 °C.

Laut Hersteller kann der Assay „Limit of Detection“ (LoD) cDNA-Templates von 1 pg bis 100 ng in nukleasefreiem Wasser nachweisen.

Zur Berechnung und Normalisierung der lncRNA-Expressionsniveaus wurde die Zyklusschwellentechnik (Ct) als Fold Change (2-ΔΔCt) verwendet, wobei GAPDH als Housekeeping-Gen verwendet wurde. ΔCt wurde durch Subtrahieren der Ct-Werte von GAPDH von den Ct-Werten von SNHG3 oder LUNAR1 erhalten (49), wobei; ΔΔCt = ΔCtCRC-Proben – ΔCtgesunde Kontrollproben 3.2.5. CEA- und CA19-9-Bestimmung durch Elektrochemilumineszenz-Immunoassay. Ein Teil der erhaltenen Seren wurde zur Bestimmung der CEA- und CA19-9-Tumormarker verwendet. Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay unter Verwendung von Cobas® e 602, entwickelt von Roche Diagnostics, GmbH, Deutschland, wurde zur Bestimmung der Serumkonzentrationen von CEA (Kat. 11731629 322) und CA19.9 (Kat. Nr. 11776193500), gemäß Herstellerprotokoll.

3.2.6. Aufzeichnung der Ergebnisse routinemäßiger biochemischer Tests aus den Patientenakten. Leberfunktionstests; Aspartataminotransferase (AST) und Alaninaminotransferase (ALT) sowie Serumkreatinin- und Serumharnstoffspiegel, Hämoglobin (Hgb), Thrombozytenzahl, Lymphozytenzahl und Prothrombinzeit (PT) wurden alle aus den Patientenakten entnommen.

3.2.7. Verhältnisse und Indizes In Metern wurden die Körpergröße der Teilnehmer und ihr Gewicht in Kilogramm aufgezeichnet, um den Body-Mass-Index (BMI in kg/m2) zu berechnen, wenn übergewichtige Probanden einen BMI von 25–29,9 haben kg/m2, 30 kg/m2 oder mehr sind fettleibig, während 18,5-24,9 kg/m2 ist ein Hinweis auf Normalgewicht, https://www.nhlbi.nih.gov/health/educational/lose_wt/BMI/bmicalc.htm Der immunantwortbezogene Entzündungsindikator-Biomarker, der den Schweregrad der begleitenden Entzündungsstörung vorhersagen kann, ist das Verhältnis von Blutplättchen zu Lymphozyten (PLR) (10,50).

3.3. Statistische Analyse mit Hilfe von GraphPad Prism® Version 9.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, SPSS 23.0 (Statistikpaket für Sozialstudiensoftware) (IBM, Armonk, NY), MedCalc Statistic Software Version 19.1 (MedCalc Software von Ostend). , Belgien) und Microsoft Office Excel 2019 wurde eine statistische Analyse durchgeführt.

Der Chi-Quadrat-Test (χ2) wurde verwendet, um die Zusammenhänge zwischen den Merkmalen der Teilnehmer und den Gruppen zu bewerten. Der Shapiro-Wilk-Normalitätstest sowie der Kolmogorov-Smirnov-Test wurden angewendet, um das Muster der Normalverteilung für beide Gruppen und Untergruppen der Daten zu bestimmen. Die Daten wurden als Mittelwert ±SD ausgedrückt, als sie den Normalitätstest bestanden. Der Student-(t)-Test wurde verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen zwei normalverteilten Gruppen zu bestimmen. Darüber hinaus wurde bei Bedarf eine einfache ANOVA (F) gefolgt von einem Post-hoc-Tukey-Mehrfachvergleichstest verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen mehreren Gruppen zu ermitteln. Die Daten, die den Normalitätstest nicht bestanden haben, wurden als Median (Interquartilbereich) (IQR) (25. Perzentil – 75. Perzentil) ausgedrückt. Der Mann-Whitney (U)-Test wurde verwendet, um die signifikanten Veränderungen zwischen zwei Teilnehmergruppen zu bestimmen. Darüber hinaus wurden bei Bedarf der Kruskal-Wallis (H)-Test und folglich der Mehrfachvergleichstest von Dunn verwendet, um festzustellen, ob es statistisch signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen gab.

Die Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve sowie die AUC wurden implementiert, um die Fähigkeiten der Serum-lncRNAs SNHG3 und LUNAR1 zur Unterscheidung zwischen Gruppen und mit Gruppen zur Identifizierung von Untergruppen zu bewerten. Der beste Cut-off, die besten Sensitivitäten (SNs), die besten Spezifitäten (SPs) sowie die negativen und positiven Vorhersagewerte NPVs bzw. PPVs wurden alle mithilfe der ROC-Kurve bestimmt, wobei der geschätzte AUC-Bereich zwischen 0 und 1 liegt.

Negative Likelihood Ratios (LRs) werden in medizinischen Tests verwendet, um die Markerdiskriminierungseffizienz zu bewerten. Das Verhältnis, das die Wahrscheinlichkeit angibt, dass eine Person an der Krankheit oder dem Leiden leidet, bestätigt die durch die ROC-Kurve identifizierten SNs und SPs. SN und SP haben eine unterschiedliche Bedeutung für LR, wobei negatives LR gleich (100-SN)/SP ist.

Mehrere Regressionsmodelle wurden verwendet, um den Einfluss der demografischen und klinisch-pathologischen Daten der Teilnehmer (als unabhängige Faktoren) auf die Expressionsniveaus der lncRNAs SNHG3 und LUNAR1 zu bewerten, die wir als abhängige Variablen betrachteten. Die Korrelation zwischen zahlreichen Variablen wurde mithilfe des Spearman-Korrelationskoeffizienten (r) bewertet. Statistische Analysetests gelten als signifikant, wenn der zweiseitige p-Wert <0,05 (*) beträgt.