Aivokasvainten etiologia ja eteneminen

Tutkimuksen tavoitteet:

1. Kerää riittävästi aivosyöpäkudosmateriaalia korkean suorituskyvyn morfologisia, proteiini-, RNA- ja DNA-analyysejä varten.
2. Yhdistää näiden analyysien kudoksiin liittyvät tulokset kliinisiin tietoihin uusien biomarkkerien potentiaalin arvioimiseksi aivokasvainten diagnoosin, ennusteen ja perinnöllisyyden arvioimiseksi.

Materiaalit ja menetelmät

Parafiiniin upotettu kasvainmateriaali

Tampereen yliopistollisen sairaalan patologian laboratorioon (Fimlab-laboratorion patologian osasto) on kerätty parafiinilohkoja yli 4000 aivokasvaimesta. Niitä on käytetty ensisijaisesti kliinisen diagnoosin tarkoituksiin, mutta potilaan tai viranomaisen suostumuksen saatuaan aineiston ylijäämä voidaan käyttää tutkimustarkoituksiin. Neuropatologi on merkinnyt kunkin kasvaimen edustavimman alueen kudoslevyyn. Näitä merkintöjä käyttämällä kasvainkudosalueet otetaan sitten biopsia kudoksen mikrosirulohkoon (Micro-Array Technology, Beecher Instruments, Inc.). Yhteen kudosmikrosirulohkoon voidaan kerätä jopa 1000 histologista näytettä, joka voidaan leikata 200 kudosleikkeeksi. Näitä leikkeitä voidaan käyttää erilaisissa analyyseissä (immunohistokemia, fluoresenssi ja kromogeeni in situ -hybridisaatio ja muut histologiset arvosanat). Menetelmän etuja ovat sen suuri kapasiteetti, automatisointipotentiaali, alkuperäisen kudoslohkon rajoitettu vaurioituminen ja optimoidut olosuhteet molekyylibiologisille analyyseille. Valmistimme ensimmäisen suomalaisen TMA-lohkon vuonna 1999. Tähän mennessä TMA:ihimme on otettu jopa 3000 erilaista aivokasvainta, joista 2000 glioomaa ja meningioomia on käytetty tässä tutkimuksessa. Seuraavassa on esimerkkejä projekteista, joissa menetelmää käytetään. Samanlaisia ​​strategioita käytetään tässä tutkimuksessa:

1. Olemme tutkineet hiilihappoanhydraasien ja aivokasvainten välistä suhdetta. Hiilianhydraasi IX (CA IX) on hypoksian aiheuttama entsyymi, joka liittyy kasvainten muodostumiseen. CA IX -immunopositiivisuus havaittiin 80 %:ssa 362 astrosyyttisestä glioomasta, jotka kerättiin kudoksen mikrosirulohkoihin. Monitekijäisen eloonjäämisanalyysin mukaan CA IX:n intensiteetti oli merkittävä ja riippumaton prognostinen tekijä. CA IX on mahdollinen ehdokas kohdennettuun hoitoon.

2. Käyttämällä cDNA-microarray-menetelmää on mahdollista analysoida useiden syöpägeenien ilmentymistä yhdessä hybridisaatiossa. cDNA-CGH-mikrosirumenetelmässä käytetään samanaikaisesti cDNA-microarray-menetelmää ja vertailevaa genomista hybridisaatiota. Tämän menetelmän avulla voimme tutkia geenin kopiomäärän ja tietyn monistetun geenin ilmentymisen välistä suhdetta ja myös määrittää suurella resoluutiolla geenit solulinjoista, jotka ovat monistuneita ja yli-ilmentyneitä. Analyysi antaa tarkennetun kuvan geenikopioluvun muutosten ja niiden ilmentymisen välisestä suhteesta erilaisissa kasvaimissa. Näillä menetelmillä olemme löytäneet useita uusia syöpägeeniehdokkaita, jotka voivat olla mukana neuroblastoomien patogeneesissä. Näiden geenien roolin varmistamiseksi olemme rakentaneet neuroblastoomakudoksen mikroryhmälohkoja ja suorittaneet FISH- ja IHC-analyysejä käyttämällä näitä TMA:ita. Onnistuimme karakterisoimaan amplifikaatioalueen, jota esiintyi lähes puolessa neuroblastoomapotilaiden kasvainnäytteistä ja joka liittyi merkittävästi potilaan eloonjäämiseen.

   Tuore kudos ja jäädytetyt kudosmikrosirut

   Patologian laitoksen tiimimme on ryhtynyt valmistautumaan molekyylibiologisiin ja geneettisiin tutkimuksiin, jotka vaativat tuoreita kudosarkistoja. Tätä tarkoitusta varten olemme systemaattisesti keränneet ja tallentaneet aivokasvainkudosta nykyaikaisia ​​syövändiagnoosin ja -tutkimuksen menetelmiä varten. Aivokasvainkudoksen käsittely, varastointi ja arkistointi neurokirurgisista leikkaussaleista osoitteessa

   Tampereen yliopistollinen sairaala hoidetaan keskitetysti patologian laitoksen pakastekudoslaboratoriossa. Tämä työ on jatkunut vuodesta 1992 ja tähän mennessä on kerätty yli 1000 tuoretta kasvainnäytettä. Näytemateriaalia käytetään tarkkaan kasvaindiagnoosiin primaaridiagnoosin vaiheessa (esim. oligodendroglioomien geneettinen 1p19q LOH -analyysi). Uusi pakastekudossovelluksemme palvelee useita uusia molekyylipatologisia menetelmiä. Olemme kehittäneet täysin uuden snap frozen -tekniikkaan perustuvan menetelmän ja tuottaneet kymmeniä näytteitä eri aivolokalisaatioista (frozen brain array). Seuraavassa on yksi esimerkki projektista, jossa käytettiin pakastekudosmenetelmää. Samanlaisia ​​periaatteita tulee käyttää tässä tutkimuksessa:

3. Olemme kehittäneet uuden menetelmän, joka mahdollistaa aivokasvainten erotusdiagnoosin leikkauksen aikana. Ultrarapid Ki-67 -värjäysmenetelmällä proliferaatiomarkkeri Ki-67 voidaan analysoida intraoperatiivisesti snap frozen -tekniikalla ja valomikroskopialla 10-15 minuutissa. Pystyimme varmistamaan menetelmän soveltuvuuden käyttämällä glioomien jäädytettyjä kudosleikkeitä, jotka oli aiemmin kerätty kudospankkiimme. Proliferaatioindeksinsä perusteella glioomat voitiin jakaa erilaisiin pahanlaatuisuusasteisiin ja ennusteryhmiin. Tätä erittäin spesifistä diagnostista menetelmää voidaan soveltaa esimerkiksi tilanteissa, joissa terapeuttisia lääkkeitä laitetaan kallonsisäiseen leikkauskenttään.

   Uutettu RNA ja DNA

   Laboratoriomme on hyvin varustettu ja valmistautunut RNA- ja DNA-tutkimuksiin. Uuton jälkeen RNA ja DNA arkistoidaan ja säilytetään -700 C:ssa myöhempää käyttöä varten. Esimerkki projekteista, jotka käyttävät tätä menetelmää:

4. Kytkentäanalyysi tarjoaa tehokkaan työkalun perhetaudeille altistavien geenien paikantamiseen, mikäli kyseessä olevaa sairautta sairastavia perheitä on riittävästi. Kytkentäanalyysiä varten genomin polymorfisia alueita tutkitaan käyttämällä kromosomialueiden markkereita, jotka ovat siirtyneet perheen perustajavanhemmilta kaikille perheen glioomia sairastaville jäsenille. Olemme keränneet veri- ja DNA-näytteitä erittäin harvinaisista glioomaperheistä (yhteensä 183 jäsentä) kytkentäanalyysiä varten. Genominlaajuisen linkitysanalyysin perusteella löysimme uuden kromosomilokuksen, joka liittyi merkittävästi familiaaliseen glioomaan. Sukuperäisten glioomapotilaiden näytteiden syvä sekvensointi on tutkimuksemme seuraava vaihe.

Tiedonkeruu

Tampereen yliopistollisen keskussairaalan patologian laitoksen neuroonkologisessa materiaalissamme on 5 000 kudosnäytettä (4 000 parafiini- ja 1 000 pakastekudosnäytettä). Tämä on liian suuri tietojoukko yksittäisten tutkijoiden hallinnoitavaksi omissa tietokantoissaan. Tavoitteenamme onkin kehittää uusi integroitu tutkimustietojärjestelmä viimeisen 30 vuoden aikana kerätyn kudosmateriaalin tehokkaaseen hallintaan, mukaan lukien yksityiskohtainen rekisteri kaikista näytteistä. Rekisteriin tulee myös digitaalista valokuvamateriaalia TMA:sta ja muista histologisista objektilaseista sekä virtuaalimikroskooppilasit. Potilaiden asiaankuuluvat kliiniset tiedot (esim. vuosina 1983-2009 leikattujen gliooma- ja meningiomapotilaiden vähintään kolmen vuoden seuranta) yhdistetään kudostietoihin Suomen viranomaisten ja Tampereen yliopistollisen sairaalan luvalla.

Hankkeessa noudatetaan Helsingin julistusta, Suomen voimassa olevaa lainsäädäntöä ja Tampereen yliopistollisen sairaalan määrittelemiä tietosuojaperiaatteita. Tämä tutkimus on retrospektiivinen ja puhtaasti havainnollinen. Lääketieteellisen toimenpiteen määrääminen ei ole tutkijan harkinnassa. Näytteiden kerääminen tutkimustarkoituksiin vaati jokaisen yksittäisen potilaan tietoisen suostumuksen perheglioomatutkimuksessa. Diagnostisen materiaalin arkistointi kudospankkiin ei aiheuta eettisiä ongelmia. Vain ylimääräistä aineistoa diagnostisista näytteistä käytetään tutkimustarkoituksiin joko potilaan tietoisena suostumuksella tai Suomen viranomaisten (Lääkäri- ja oikeusasiainministeriö) luvalla. Tampereen yliopistollisen sairaalan eettinen toimikunta on antanut luvan hankkeellemme (R07042). Perheglioomatutkimus tehdään erillisellä luvalla (Sosiaali- ja terveysministeriö, päiväkirjanumero 127/08/95). Tutkimusluvat on saatu myös Suomen kudoslain perusteella (Valvira: Päiväkirjanumero 7796/05.01.00.06/2011).