Die Ätiologie und das Fortschreiten von Hirntumoren

Ziele der Studie:

1. Sammeln von ausreichend Hirntumor-Gewebematerial für morphologische, Protein-, RNA- und DNA-Analysen mit hohem Durchsatz.
2. Kombination gewebebezogener Ergebnisse dieser Analysen mit klinischen Daten, um das Potenzial der neuen Biomarker zur Beurteilung von Diagnose, Prognose und Vererbung von Hirntumoren zu untersuchen.

Materialen und Methoden

In Paraffin eingebettetes Tumormaterial

Paraffinblöcke von mehr als 4.000 Hirntumoren wurden im Labor für Pathologie des Universitätsklinikums Tampere (Abteilung für Pathologie im Fimlab-Labor) gesammelt. Sie wurden in erster Linie für Zwecke der klinischen Diagnose verwendet, aber sobald die Zustimmung des Patienten oder der Behörde eingeholt wurde, kann der Überschuss des Materials für Forschungszwecke verwendet werden. Ein Neuropathologe hat die repräsentativste Region jedes Tumors auf einem Gewebeträger markiert. Mithilfe dieser Markierungen werden Tumorgeweberegionen dann in den Gewebe-Microarray-Block (Micro-Array Technology, Beecher Instruments, Inc.) biopsiert. Bis zu 1.000 histologische Proben können in einem Gewebe-Microarray-Block gesammelt werden, der in 200 Gewebeschnitte geschnitten werden kann. Diese Abschnitte können in verschiedenen Arten von Analysen verwendet werden (Immunhistochemie, Fluoreszenz und Chromogen-in-situ-Hybridisierung und andere histologische Untersuchungen). Zu den Vorteilen der Methode zählen ihre hohe Kapazität, das Automatisierungspotenzial, die begrenzte Schädigung des ursprünglichen Gewebeblocks und optimierte Bedingungen für molekularbiologische Analysen. Den ersten finnischen TMA-Block haben wir 1999 hergestellt. Bisher wurden bis zu 3000 verschiedene Hirntumoren in unseren TMAs untersucht, von denen 2000 Gliome und Meningeome für diese Studie verwendet werden. Im Folgenden finden Sie Beispiele für Projekte, in denen die Methode zum Einsatz kommt. Ähnliche Strategien werden in der vorliegenden Studie verwendet:

1. Wir haben den Zusammenhang zwischen Carboanhydrasen und Hirntumoren untersucht. Carboanhydrase IX (CA IX) ist ein Hypoxie-induziertes Enzym, das mit der Tumorentstehung assoziiert ist. CA IX-Immunpositivität wurde bei 80 % der 362 astrozytären Gliome gefunden, die in Gewebe-Microarray-Blöcken gesammelt wurden. Laut multifaktorieller Überlebensanalyse war die CA IX-Intensität ein signifikanter und unabhängiger Prognosefaktor. CA IX ist ein möglicher Kandidat für eine gezielte Therapie.

2. Mit der cDNA-Microarray-Methode ist es möglich, die Expression mehrerer Krebsgene in einer Hybridisierung zu analysieren. Die cDNA-CGH-Microarray-Methode nutzt gleichzeitig die cDNA-Microarray-Methode und die vergleichende genomische Hybridisierung. Mit dieser Methode können wir die Beziehung zwischen der Anzahl der Genkopien und der Expression des jeweiligen amplifizierten Gens untersuchen und außerdem mit hoher Auflösung die Gene in Zelllinien definieren, die amplifiziert und überexprimiert werden. Die Analyse liefert ein genaueres Bild der Beziehung zwischen Veränderungen in der Genkopienzahl und ihrer Expression in verschiedenen Arten von Tumoren. Mit diesen Methoden haben wir mehrere neue Krebsgenkandidaten gefunden, die möglicherweise an der Pathogenese von Neuroblastomen beteiligt sind. Um die Rolle dieser Gene sicherzustellen, haben wir Mikroarray-Blöcke für Neuroblastomgewebe gebaut und FISH- und IHC-Analysen mit diesen TMAs durchgeführt. Es gelang uns, eine Amplifikationsregion zu charakterisieren, die in fast der Hälfte der Tumorproben von Neuroblastom-Patienten vorkam und signifikant mit dem Überleben der Patienten assoziiert war.

   Mikroarrays aus frischem Gewebe und gefrorenem Gewebe

   Unser Team in der Abteilung für Pathologie hat Schritte unternommen, um molekularbiologische und genetische Studien vorzubereiten, die frische Gewebearchive erfordern. Zu diesem Zweck haben wir Hirntumorgewebe für moderne Methoden der Krebsdiagnose und -forschung systematisch gesammelt und erfasst. Die Verarbeitung, Lagerung und Archivierung von Hirntumorgewebe aus neurochirurgischen Operationssälen

   Die Untersuchungen des Universitätsklinikums Tampere erfolgen zentral im Labor für gefrorenes Gewebe der Abteilung für Pathologie. Diese Arbeit läuft seit 1992 und mittlerweile wurden mehr als 1.000 frische Tumorproben gesammelt. Das Probenmaterial dient der genauen Tumordiagnose in der Phase der Primärdiagnose (z.B. genetische 1p19q-LOH-Analyse von Oligodendrogliomen). Unsere neuartige gefrorene Gewebeanwendung dient mehreren neuen molekularpathologischen Methoden. Wir haben eine völlig neue Methode entwickelt, die auf der Snap-Frozen-Technik basiert, und Dutzende Proben aus verschiedenen Hirnlokalisationen hergestellt (Frozen Brain Array). Im Folgenden finden Sie ein Beispiel für ein Projekt, bei dem die Methode des gefrorenen Gewebes verwendet wurde. Ähnliche Prinzipien sollen in der vorliegenden Studie verwendet werden:

3. Wir haben eine neue Methode entwickelt, die die Differentialdiagnose von Hirntumoren während einer Operation erleichtert. Mit der Ultrarapid Ki-67-Färbemethode kann der Proliferationsmarker Ki-67 intraoperativ mit der Snap-Frozen-Technik und der Lichtmikroskopie innerhalb von 10 – 15 Minuten analysiert werden. Wir konnten die Anwendbarkeit der Methode anhand von gefrorenen Gewebeschnitten von Gliomen überprüfen, die zuvor in unserer Gewebebank gesammelt wurden. Anhand ihrer Proliferationsindizes konnten die Gliome in verschiedene Malignitätsgrade und Prognosegruppen eingeteilt werden. Diese hochspezifische Diagnosemethode kann beispielsweise dann angewendet werden, wenn therapeutische Medikamente in ein intrakranielles Operationsfeld eingebracht werden.

   Extrahierte RNA und DNA

   Unser Labor ist gut ausgestattet und auf RNA- und DNA-Studien vorbereitet. Nach der Extraktion werden RNA und DNA archiviert und zur späteren Verwendung bei -700 °C aufbewahrt. Beispiel für Projekte, die diese Methode verwenden:

4. Die Kopplungsanalyse bietet ein leistungsstarkes Werkzeug zur Lokalisierung von Genen, die für familiäre Krankheiten prädisponieren, vorausgesetzt, es gibt genügend Familien mit der betreffenden Krankheit. Zur Kopplungsanalyse werden die polymorphen Regionen des Genoms anhand von Markern chromosomaler Regionen untersucht, die von den Gründereltern der Familie an alle Mitglieder mit Gliomen in der Familie weitergegeben wurden. Für die Kopplungsanalyse haben wir Blut- und DNA-Proben von sehr seltenen Gliomfamilien (mit insgesamt 183 Mitgliedern) gesammelt. Auf der Grundlage einer genomweiten Verknüpfungsanalyse fanden wir einen neuen Chromosomenort, der signifikant mit dem familiären Gliom assoziiert war. Der nächste Schritt unserer Studie ist die Tiefensequenzierung der Proben von Patienten mit familiärem Gliom.

Datensammlung

Unser neuroonkologisches Material in der Abteilung für Pathologie des Universitätsklinikums Tampere umfasst 5.000 Gewebeproben (4.000 Paraffin- und 1.000 gefrorene Gewebeproben). Dies ist ein zu großer Datensatz, als dass er von einzelnen Forschern in ihren eigenen Datenbanken verwaltet werden könnte. Unser Ziel ist es daher, ein neues integriertes Forschungsdatensystem zur effektiven Verwaltung des in den letzten 30 Jahren gesammelten Gewebematerials zu entwickeln, einschließlich eines detaillierten Registers aller Proben. Das Register umfasst auch digitales Fotomaterial von TMA und anderen histologischen Objektträgern sowie virtuelle Mikroskopie-Objektträger. Die relevanten klinischen Daten der Patienten (z. B. mindestens dreijährige Nachbeobachtung von Gliom- und Meningeompatienten, die zwischen 1983 und 2009 operiert wurden) werden mit Genehmigung der finnischen Behörden und des Universitätsklinikums Tampere mit den Gewebedaten kombiniert.

Das Projekt beachtet die Helsinki-Erklärung, die aktuelle finnische Gesetzgebung und die vom Universitätskrankenhaus Tampere festgelegten Grundsätze des Datenschutzes. Diese Studie ist retrospektiv und rein beobachtend. Die Zuordnung des medizinischen Eingriffs liegt nicht im Ermessen des Prüfers. Die Entnahme von Proben zu Forschungszwecken erforderte in der Studie zu familiären Gliomen die Einverständniserklärung jedes einzelnen Patienten. Die Archivierung von diagnostischem Material in einer Gewebebank stellt keine ethischen Probleme dar. Für Forschungszwecke wird nur überschüssiges Material aus diagnostischen Proben verwendet, entweder mit der Einwilligung des Patienten nach Aufklärung oder mit Genehmigung der zuständigen finnischen Behörden (der Nationalen Behörde für gerichtsmedizinische Angelegenheiten Finnlands). Die Ethikkommission des Universitätsklinikums Tampere hat die Genehmigung für unser Projekt erteilt (R07042). Die Studie zu familiären Gliomen wird im Rahmen einer gesonderten Genehmigung durchgeführt (Ministerium für Soziales und Gesundheit, Tagebuch Nr. 127/08/95). Forschungsgenehmigungen wurden auch auf der Grundlage des finnischen Gewebegesetzes eingeholt (Valvira: Tagebuch Nr. 7796/05.01.00.06/2011).