L'eziologia e la progressione dei tumori cerebrali

Obiettivi dello studio:

1. Raccogliere materiale di tessuto tumorale cerebrale adeguato per analisi morfologiche, proteiche, RNA e DNA ad alto rendimento.
2. Combinare i risultati relativi ai tessuti di queste analisi con i dati clinici per esaminare il potenziale dei nuovi biomarcatori per valutare la diagnosi, la prognosi e l'ereditarietà dei tumori cerebrali.

Materiali e metodi

Materiale tumorale incluso in paraffina

Blocchi di paraffina di oltre 4.000 tumori cerebrali sono stati raccolti nel Laboratorio di Patologia dell'Ospedale Universitario di Tampere (Dipartimento di Patologia nel Laboratorio Fimlab). Sono stati utilizzati principalmente per scopi di diagnosi clinica, ma una volta ottenuto il consenso del paziente o dell'autorità, il materiale in eccesso può essere utilizzato per scopi di ricerca. Un neuropatologo ha contrassegnato la regione più rappresentativa di ciascun tumore in un vetrino di tessuto. Utilizzando questi contrassegni, le regioni del tessuto tumorale vengono quindi sottoposte a biopsia nel blocco di microarray tissutale (Micro-Array Technology, Beecher Instruments, Inc.). È possibile raccogliere fino a 1.000 campioni istologici in un blocco di microarray tissutale, che può essere tagliato in 200 sezioni di tessuto. Queste sezioni possono essere utilizzate in vari tipi di analisi (immunoistochimica, fluorescenza e ibridazione cromogena in situ e altre classificazioni istologiche). Tra i vantaggi del metodo vi sono la sua elevata capacità, il potenziale di automazione, il danno limitato al blocco di tessuto originale e le circostanze ottimizzate per le analisi biologiche molecolari. Abbiamo prodotto il primo blocco TMA finlandese nel 1999. Fino ad ora fino a 3000 diversi tumori cerebrali sono stati campionati al nostro TMA: s di cui 2000 gliomi e meningiomi sono utilizzati per questo studio. Di seguito vengono forniti esempi di progetti in cui viene utilizzato il metodo. Strategie simili sono utilizzate nel presente studio:

1. Abbiamo studiato la relazione tra anidrasi carbonica e tumori cerebrali. L'anidrasi carbonica IX (CA IX) è un enzima indotto dall'ipossia associato alla tumorigenesi. L'immunopositività di CA IX è stata trovata nell'80% di 362 gliomi astrocitici raccolti in blocchi di microarray tissutali. Secondo l'analisi di sopravvivenza multifattoriale, l'intensità del CA IX era un fattore prognostico significativo e indipendente. CA IX è un possibile candidato per la terapia mirata.

2. Utilizzando il metodo cDNA-microarray è possibile analizzare l'espressione di diversi geni del cancro in un'unica ibridazione. Il metodo del microarray cDNA-CGH fa uso simultaneo del metodo del microarray cDNA e dell'ibridazione genomica comparativa. Questo metodo ci permette di studiare la relazione tra il numero di copie del gene e l'espressione del particolare gene amplificato, e anche di definire, ad alta risoluzione, i geni nelle linee cellulari che sono amplificati e sovraespressi. L'analisi fornisce un quadro più mirato della relazione tra i cambiamenti nel numero di copie geniche e la loro espressione in diversi tipi di tumori. Con questi metodi abbiamo trovato diversi nuovi geni candidati del cancro che potrebbero essere coinvolti nella patogenesi dei neuroblastomi. Per garantire il ruolo di questi geni abbiamo costruito blocchi di microarray di tessuto di neuroblastoma ed eseguito analisi FISH e IHC utilizzando questi TMA. Siamo riusciti a caratterizzare una regione di amplificazione che si verificava in quasi la metà dei campioni tumorali di pazienti con neuroblastoma e che era significativamente associata alla sopravvivenza del paziente.

   Microarray di tessuto fresco e tessuto congelato

   Il nostro team presso il Dipartimento di Patologia ha preso provvedimenti per prepararsi a studi di biologia molecolare e genetica che richiedono archivi di tessuti freschi. A tal fine abbiamo sistematicamente raccolto e registrato il tessuto tumorale cerebrale per i moderni metodi di diagnosi e ricerca sul cancro. L'elaborazione, la conservazione e l'archiviazione del tessuto tumorale cerebrale dalle sale operatorie neurochirurgiche a

   L'ospedale universitario di Tampere viene svolto a livello centrale presso il laboratorio di tessuti congelati del Dipartimento di patologia. Questo lavoro è in corso dal 1992 e ad oggi sono stati raccolti più di 1.000 campioni di tumori freschi. Il materiale campione viene utilizzato per la diagnosi esatta del tumore nella fase della diagnosi primaria (ad es. analisi genetica 1p19q LOH degli oligodendrogliomi). La nostra nuova applicazione di tessuto congelato serve diversi nuovi metodi patologici molecolari. Abbiamo sviluppato un metodo completamente nuovo basato sulla tecnica snap frozen e prodotto dozzine di campioni da diverse localizzazioni cerebrali (frozen brain array). Quanto segue fornisce un esempio di un progetto in cui è stato utilizzato il metodo del tessuto congelato. Principi simili devono essere utilizzati nel presente studio:

3. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo che facilita la diagnosi differenziale dei tumori cerebrali durante l'operazione. Utilizzando il metodo di colorazione Ultrarapid Ki-67, il marker di proliferazione Ki-67 può essere analizzato intraoperatoriamente con la tecnica snap frozen e la microscopia ottica entro 10-15 minuti. Siamo stati in grado di accertare l'applicabilità del metodo utilizzando sezioni di tessuto congelato di gliomi che erano state precedentemente raccolte nella nostra banca dei tessuti. Sulla base dei loro indici di proliferazione, i gliomi potrebbero essere suddivisi in diversi gradi di malignità e gruppi di prognosi. Questo metodo diagnostico altamente specifico può essere applicato ad esempio in situazioni in cui i farmaci terapeutici vengono immessi in un campo operatorio intracranico.

   RNA e DNA estratti

   Il nostro laboratorio è ben attrezzato e preparato per gli studi di RNA e DNA. Dopo l'estrazione, l'RNA e il DNA vengono archiviati e conservati a -700 C per un uso successivo. Esempio di progetti che utilizzano questo metodo:

4. L'analisi di linkage offre un potente strumento per localizzare i geni che predispongono alle malattie familiari, a condizione che vi sia un numero sufficiente di famiglie con la malattia in questione. Per l'analisi di linkage, le regioni polimorfiche del genoma vengono studiate utilizzando marcatori di regioni cromosomiche che sono state trasmesse dai genitori fondatori della famiglia a tutti i membri con gliomi della famiglia. Abbiamo raccolto campioni di sangue e DNA da famiglie di gliomi molto rari (con un totale di 183 membri) ai fini dell'analisi di linkage. Sulla base dell'analisi del linkage dell'intero genoma, abbiamo trovato un nuovo locus cromosomico che era significativamente associato al glioma familiare. Il sequenziamento profondo dei campioni di pazienti affetti da glioma familiare è il passo successivo del nostro studio.

Raccolta dati

Il nostro materiale neuro-oncologico presso il Dipartimento di Patologia dell'Ospedale Universitario di Tampere comprende 5.000 campioni di tessuto (4.000 paraffina e 1.000 campioni di tessuto congelato). Questo è un set di dati troppo grande per essere gestito dai singoli ricercatori nei propri database. Il nostro obiettivo è quindi quello di sviluppare un nuovo sistema integrato di dati di ricerca per la gestione efficace del materiale tissutale raccolto negli ultimi 30 anni, che includa un registro dettagliato di tutti i campioni. Il registro includerà anche materiale fotografico digitale da TMA e altri vetrini istologici, nonché vetrini di microscopia virtuale. I dati clinici rilevanti dei pazienti (ad esempio follow-up di almeno tre anni di pazienti con glioma e meningioma operati nel periodo 1983-2009) sono combinati con i dati sui tessuti con il permesso delle autorità finlandesi e dell'ospedale universitario di Tampere.

Il progetto rispetta la Dichiarazione di Helsinki, l'attuale legislazione finlandese ei principi di protezione dei dati, stabiliti dall'Ospedale Universitario di Tampere. Questo studio è retrospettivo e puramente osservativo. L'assegnazione dell'intervento medico non è a discrezione dello sperimentatore. La raccolta di campioni per scopi di ricerca ha richiesto il consenso informato di ogni singolo paziente nello studio sul glioma familiare. L'archiviazione del materiale diagnostico in una banca dei tessuti non comporta problemi etici. Solo il materiale in eccesso proveniente da campioni diagnostici viene utilizzato per scopi di ricerca, con il consenso informato del paziente o con l'autorizzazione delle autorità finlandesi competenti (l'Autorità nazionale per gli affari medico-legali della Finlandia). Il Comitato Etico dell'Ospedale Universitario di Tampere ha dato il permesso per il nostro progetto (R07042). Lo studio del glioma familiare è condotto con un permesso separato (Ministero degli Affari Sociali e della Salute, Diario numero 127/08/95). Sono stati ottenuti anche permessi di ricerca sulla base della legge finlandese sui tessuti (Valvira: Diario numero 7796/05.01.00.06/2011).