Etiologin och utvecklingen av hjärntumörer

Studiens syfte:

1. Att samla in adekvat material för hjärncancervävnad för morfologiska, protein-, RNA- och DNA-analyser med hög genomströmning.
2. Att kombinera vävnadsrelaterade resultat av dessa analyser med kliniska data för att undersöka potentialen hos de nya biomarkörerna för att bedöma diagnos, prognos och ärftlighet av hjärntumörer.

Material och metoder

Paraffininbäddat tumörmaterial

Paraffinblock av mer än 4 000 hjärntumörer har samlats in i patologiska laboratoriet vid Tammerfors universitetssjukhus (patologiska institutionen i Fimlab-laboratoriet). De har främst använts för klinisk diagnos, men när patientens eller myndighetens medgivande har erhållits kan överskottet av materialet användas för forskningsändamål. En neuropatolog har markerat den mest representativa regionen av varje tumör i en vävnadsbild. Med användning av dessa markeringar biopsieras sedan tumörvävnadsregioner in i vävnadsmikroarrayblocket (Micro-Array Technology, Beecher Instruments, Inc.). Upp till 1 000 histologiska prover kan samlas in i ett vävnadsmikroarrayblock, som kan skäras i 200 vävnadssektioner. Dessa sektioner kan användas i olika typer av analyser (immunohistokemi, fluorescens och kromogen in situ hybridisering och andra histologiska ställningar). Bland fördelarna med metoden är dess höga kapacitet, potential för automatisering, begränsad skada på det ursprungliga vävnadsblocket och optimerade omständigheter för molekylärbiologiska analyser. Vi tillverkade det första finska TMA-blocket 1999. Hittills har upp till 3000 olika hjärntumörer provtagits till våra TMA:er, varav 2000 gliom och meningiom används för denna studie. Följande ger exempel på projekt där metoden används. Liknande strategier används i denna studie:

1. Vi har studerat sambandet mellan kolsyraanhydraser och hjärntumörer. Kolsyraanhydras IX (CA IX) är ett hypoxiinducerat enzym som är associerat med tumörbildning. CA IX-immunopositivitet hittades i 80 % av 362 astrocytiska gliom samlade i vävnadsmikroarrayblock. Enligt multifaktoriell överlevnadsanalys var CA IX-intensitet en signifikant och oberoende prognostisk faktor. CA IX är en möjlig kandidat för riktad terapi.

2. Genom att använda cDNA-microarray-metoden är det möjligt att analysera uttrycket av flera cancergener i en hybridisering. cDNA-CGH-mikroarraymetoden använder samtidigt cDNA-mikroarraymetoden och jämförande genomisk hybridisering. Denna metod gör det möjligt för oss att studera sambandet mellan antalet genkopior och uttrycket av den specifika amplifierade genen, och även att vid hög upplösning definiera generna i cellinjer som amplifieras och överuttrycks. Analysen ger en mer fokuserad bild av sambandet mellan förändringar i antal genkopior och deras uttryck i olika typer av tumörer. Med dessa metoder har vi hittat flera nya cancergenkandidater som kan vara involverade i patogenesen av neuroblastom. För att säkerställa rollen för dessa gener har vi byggt neuroblastomvävnadsmikroarrayblock och utfört FISH- och IHC-analyser med dessa TMA:er. Vi lyckades karakterisera en amplifieringsregion som förekom i nästan hälften av tumörproverna hos neuroblastompatienter och som var signifikant associerad med patientöverlevnad.

   Färsk vävnad och fryst vävnad mikroarrayer

   Vårt team vid institutionen för patologi har vidtagit åtgärder för att förbereda sig för molekylärbiologiska och genetiska studier som kräver färska vävnadsarkiv. För detta ändamål har vi systematiskt samlat in och registrerat hjärntumörvävnad för moderna metoder för cancerdiagnostik och forskning. Bearbetning, lagring och arkivering av hjärntumörvävnad från de neurokirurgiska operationssalarna vid

   Tammerfors universitetssjukhus bedrivs centralt vid Institutionen för patologiska djupfrysta vävnader. Detta arbete har pågått sedan 1992 och nu har mer än 1 000 färska tumörprover samlats in. Provmaterialet används för exakt tumördiagnos i fasen av primär diagnos (t.ex. genetisk 1p19q LOH-analys av oligodendrogliom). Vår nya applikation för fryst vävnad tjänar flera nya molekylärpatologiska metoder. Vi har utvecklat en helt ny metod baserad på snap frozen-tekniken och tagit fram dussintals prover från olika hjärnlokaliseringar (frozen brain array). Följande ger ett exempel på ett projekt där metoden för fryst vävnad användes. Liknande principer ska användas i denna studie:

3. Vi har utvecklat en ny metod som underlättar differentialdiagnostik av hjärntumörer under operation. Med hjälp av Ultrarapid Ki-67-färgningsmetoden kan proliferationsmarkören Ki-67 analyseras intraoperativt med snabbfryst teknik och ljusmikroskopi inom 10 - 15 minuter. Vi kunde fastställa tillämpligheten av metoden med hjälp av frusna vävnadssnitt av gliom som tidigare hade samlats in i vår vävnadsbank. På basis av deras proliferationsindex kunde gliomen delas in i olika malignitetsgrader och prognosgrupper. Denna mycket specifika diagnostiska metod kan användas till exempel i situationer där terapeutiska läkemedel placeras i ett intrakraniellt operationsfält.

   Extraherat RNA och DNA

   Vårt laboratorium är välutrustat och förberett för RNA- och DNA-studier. Efter extraktion arkiveras RNA och DNA och förvaras vid -700 C för senare användning. Exempel på projekt som använder denna metod:

4. Länkanalys erbjuder ett kraftfullt verktyg för att lokalisera gener som predisponerar för familjär sjukdomar, förutsatt att det finns tillräckligt många familjer med den aktuella sjukdomen. För länkanalys undersöks de polymorfa regionerna i genomet med hjälp av markörer för kromosomala regioner som har överförts från familjens grundare till alla medlemmar med gliom i familjen. Vi har samlat in blod- och DNA-prover från mycket sällsynta gliomfamiljer (med totalt 183 medlemmar) för kopplingsanalys. På basis av genomomfattande kopplingsanalys fann vi ett nytt kromosomlokus som var signifikant associerat med det familjära gliomet. Djup sekvensering av proverna från familjär gliompatienter är följande steg i vår studie.

Datainsamling

Vårt neuro-onkologiska material vid Tammerfors universitetssjukhus patologiska avdelningen omfattar 5 000 vävnadsprover (4 000 paraffin och 1 000 frysta vävnadsprover). Detta är en för stor datauppsättning för att hanteras av enskilda forskare i sina egna databaser. Vårt mål är därför att utveckla ett nytt integrerat forskningsdatasystem för effektiv hantering av det vävnadsmaterial som har samlats in under de senaste 30 åren, inklusive ett detaljerat register över alla prover. Registret kommer även att innehålla digitalt fotomaterial från TMA och andra histologiska objektglas samt virtuella objektglas. Relevanta kliniska data från patienterna (t.ex. minst tre års uppföljning av gliom- och meningeompatienter som opererades under 1983 - 2009) kombineras med vävnadsdata med tillstånd av finska myndigheter och Tammerfors universitetssjukhus.

Projektet följer Helsingforsdeklarationen, gällande finsk lagstiftning och principerna för dataskydd som fastställts av Tammerfors universitetssjukhus. Denna studie är retrospektiv och rent observationell. Tilldelningen av den medicinska insatsen är inte efter utredarens gottfinnande. Insamlingen av prover för forskningsändamål krävde varje enskild patients informerade samtycke i den familjära gliomstudien. Arkivering av diagnostiskt material i en vävnadsbank innebär inga etiska problem. Endast överskottsmaterial från diagnostiska prover används för forskningsändamål, antingen med patientens informerade samtycke eller med tillstånd från relevanta finska myndigheter (Riksmyndigheten för medicinska ärenden i Finland). Etikkommittén vid Tammerfors universitetssjukhus har gett tillstånd för vårt projekt (R07042). Den familjära gliomstudien genomförs med ett separat tillstånd (Social- och hälsovårdsdepartementet, dagbok nummer 127/08/95). Forskningstillstånd har också erhållits på grundval av den finska vävnadslagen (Valvira: Dagbok nummer 7796/05.01.00.06/2011).