Etiologie a progrese mozkových nádorů

Cíle studie:

1. Shromáždit adekvátní materiál tkáně rakoviny mozku pro vysoce výkonné morfologické analýzy, analýzy proteinů, RNA a DNA.
2. Zkombinovat tkáňové výsledky těchto analýz s klinickými daty za účelem prozkoumání potenciálu nových biomarkerů pro posouzení diagnózy, prognózy a dědičnosti mozkových nádorů.

Materiály a metody

Nádorový materiál zalitý v parafínu

Parafínové bloky více než 4 000 mozkových nádorů byly odebrány do Laboratoře patologie ve Fakultní nemocnici Tampere (Oddělení patologie v laboratoři Fimlab). Používaly se primárně pro účely klinické diagnózy, ale jakmile byl získán souhlas pacienta nebo autority, může být přebytek materiálu použit pro výzkumné účely. Neuropatolog označil nejreprezentativnější oblast každého nádoru na tkáňovém sklíčku. S použitím těchto značek jsou pak oblasti nádorové tkáně biopsií do tkáňového mikročipového bloku (Micro-Array Technology, Beecher Instruments, Inc.). Do jednoho tkáňového mikročipového bloku lze shromáždit až 1 000 histologických vzorků, které lze rozřezat na 200 tkáňových řezů. Tyto řezy lze použít v různých druzích analýz (imunohistochemie, fluorescence a chromogenní in situ hybridizace a další histologická hodnocení). Mezi výhody metody patří její vysoká kapacita, potenciál pro automatizaci, omezené poškození původního tkáňového bloku a optimalizované podmínky pro molekulárně biologické analýzy. První finský blok TMA jsme vyrobili v roce 1999. Až dosud bylo našim TMA odebráno až 3000 různých mozkových nádorů, z nichž 2000 gliomů a meningeomů bylo použito pro tuto studii. Níže jsou uvedeny příklady projektů, ve kterých je metoda použita. Podobné strategie jsou použity v této studii:

1. Studovali jsme vztah mezi karboanhydrázami a mozkovými nádory. Karboanhydráza IX (CA IX) je enzym indukovaný hypoxií, který je spojen s tumorigenezí. Imunopozitivita CA IX byla nalezena u 80 % z 362 astrocytárních gliomů odebraných v tkáňových mikročipových blocích. Podle multifaktoriální analýzy přežití byla intenzita CA IX významným a nezávislým prognostickým faktorem. CA IX je možným kandidátem pro cílenou terapii.

2. Použitím cDNA-microarray metody je možné analyzovat expresi několika rakovinných genů v jedné hybridizaci. Metoda cDNA-CGH microarray využívá simultánně metodu cDNA-microarray a komparativní genomovou hybridizaci. Tato metoda nám umožňuje studovat vztah mezi počtem kopií genu a expresí konkrétního amplifikovaného genu a také definovat ve vysokém rozlišení geny v buněčných liniích, které jsou amplifikovány a nadměrně exprimovány. Analýza poskytuje konkrétnější obrázek o vztahu mezi změnami v počtu kopií genu a jejich expresí u různých druhů nádorů. Pomocí těchto metod jsme našli několik nových kandidátů na rakovinné geny, které se mohou podílet na patogenezi neuroblastomů. Abychom zajistili roli těchto genů, vytvořili jsme mikromatice bloky neuroblastomové tkáně a provedli jsme analýzy FISH a IHC pomocí těchto TMA. Podařilo se nám charakterizovat oblast amplifikace, která se vyskytla u téměř poloviny vzorků nádorů pacientů s neuroblastomem a která byla významně spojena s přežitím pacientů.

   Mikročipy čerstvé tkáně a zmrazené tkáně

   Náš tým na katedře patologie podniká kroky k přípravě na molekulárně biologické a genetické studie, které vyžadují čerstvé tkáňové archivy. Za tímto účelem jsme systematicky sbírali a zaznamenávali tkáň mozkového nádoru pro moderní metody diagnostiky a výzkumu rakoviny. Zpracování, uchovávání a archivace mozkové nádorové tkáně z neurochirurgických operačních sálů na at

   Fakultní nemocnice v Tampere se provádějí centrálně na Ústavu patologie v laboratoři zmrazené tkáně. Tato práce probíhá od roku 1992 a do současnosti bylo shromážděno více než 1 000 čerstvých vzorků nádorů. Vzorkový materiál slouží pro přesnou diagnostiku nádoru ve fázi primární diagnózy (např. genetická 1p19q LOH analýza oligodendrogliomů). Naše nová aplikace zmrazené tkáně slouží několika novým molekulárně patologickým metodám. Vyvinuli jsme zcela novou metodu založenou na technice rychlého zmrazení a vyrobili desítky vzorků z různých lokalizací mozku (zmrazené pole mozku). Následuje jeden příklad projektu, ve kterém byla použita metoda zmrazené tkáně. V této studii je třeba použít podobné principy:

3. Vyvinuli jsme novou metodu, která usnadňuje diferenciální diagnostiku mozkových nádorů během operace. Pomocí metody barvení Ultrarapid Ki-67 lze proliferační marker Ki-67 analyzovat intraoperačně technikou rychlého zmrazení a světelnou mikroskopií během 10 - 15 minut. Podařilo se nám ověřit použitelnost metody pomocí zmrazených tkáňových řezů gliomů, které byly dříve odebrány do naší tkáňové banky. Na základě jejich proliferačních indexů lze gliomy rozdělit do různých stupňů malignity a prognózních skupin. Tato vysoce specifická diagnostická metoda může být aplikována například v situacích, kdy jsou terapeutická léčiva umístěna do intrakraniálního operačního pole.

   Extrahovaná RNA a DNA

   Naše laboratoř je dobře vybavena a připravena pro studie RNA a DNA. Po extrakci jsou RNA a DNA archivovány a uchovávány při -700 C pro pozdější použití. Příklad projektů, které používají tuto metodu:

4. Vazebná analýza nabízí mocný nástroj pro lokalizaci genů, které predisponují k familiárním onemocněním, za předpokladu, že existuje dostatečný počet rodin s dotyčným onemocněním. Pro analýzu vazeb jsou polymorfní oblasti genomu zkoumány pomocí markerů chromozomálních oblastí, které byly předány od rodičů zakladatelů rodiny všem členům s gliomy v rodině. Odebrali jsme vzorky krve a DNA z velmi vzácných rodin gliomů (s celkem 183 členy) pro účely vazebné analýzy. Na základě celogenomové vazebné analýzy jsme našli nový chromozomový lokus, který byl významně asociován s familiárním gliomem. Hluboké sekvenování vzorků pacientů s familiárním gliomem je dalším krokem naší studie.

Sběr dat

Náš neuroonkologický materiál na oddělení patologie Fakultní nemocnice v Tampere obsahuje 5 000 vzorků tkání (4 000 parafínových a 1 000 zmrazených vzorků tkáně). Jedná se o příliš velký soubor dat na to, aby jej mohli jednotliví výzkumníci spravovat ve svých vlastních databázích. Naším cílem je proto vyvinout nový integrovaný výzkumný datový systém pro efektivní správu tkáňového materiálu, který byl shromážděn za posledních 30 let, včetně podrobného registru všech vzorků. Součástí registru bude také digitální fotografický materiál z TMA a další histologická preparáty a také preparáty pro virtuální mikroskopii. Relevantní klinická data pacientů (např. alespoň tříleté sledování pacientů s gliomem a meningeomem operovaných v letech 1983 - 2009) jsou kombinována s údaji o tkáních se souhlasem finských úřadů a univerzitní nemocnice v Tampere.

Projekt dodržuje Helsinskou deklaraci, současnou finskou legislativu a zásady ochrany dat, které stanovila Fakultní nemocnice v Tampere. Tato studie je retrospektivní a čistě observační. Zadání lékařského zásahu není na uvážení zkoušejícího. Sběr vzorků pro výzkumné účely vyžadoval informovaný souhlas každého jednotlivého pacienta ve studii familiárního gliomu. Archivace diagnostického materiálu v tkáňové bance nepředstavuje žádné etické problémy. Pro výzkumné účely se používá pouze přebytečný materiál z diagnostických vzorků, a to buď s informovaným souhlasem pacienta, nebo s povolením příslušných finských úřadů (Finský národní úřad pro lékařské záležitosti). Etická komise Fakultní nemocnice v Tampere udělila povolení pro náš projekt (R07042). Studie familiárního gliomu se provádí na základě samostatného povolení (Ministerstvo sociálních věcí a zdravotnictví, číslo deníku 127/08/95). Povolení k výzkumu byla také získána na základě finského tkáňového zákona (Valvira: číslo deníku 7796/05.01.00.06/2011).