Этиология и прогрессирование опухолей головного мозга

Цели исследования:

1. Собрать адекватный материал ткани рака головного мозга для высокопроизводительного морфологического анализа, анализа белков, РНК и ДНК.
2. Объединить результаты этих анализов, связанные с тканями, с клиническими данными, чтобы изучить потенциал новых биомаркеров для оценки диагностики, прогноза и наследственности опухолей головного мозга.

Материалы и методы

Опухолевой материал, залитый парафином

Парафиновые блоки более чем 4000 опухолей головного мозга были собраны в Лаборатории патологии университетской больницы Тампере (отделение патологии лаборатории Fimlab). Они использовались в основном для целей клинической диагностики, но после получения согласия пациента или властей излишек материала можно использовать в исследовательских целях. Невропатолог отметил наиболее репрезентативную область каждой опухоли на предметном стекле. Используя эти маркировки, участки опухолевой ткани затем подвергают биопсии в блок тканевых микрочипов (Micro-Array Technology, Beecher Instruments, Inc.). В один блок тканевых микрочипов можно собрать до 1000 гистологических образцов, которые можно разрезать на 200 срезов тканей. Эти срезы могут быть использованы в различных видах анализа (иммуногистохимия, флуоресценция и хромогенная гибридизация in situ и другие гистологические анализы). Среди преимуществ метода — его высокая производительность, возможность автоматизации, ограниченное повреждение исходного блока ткани и оптимизированные условия для молекулярно-биологических анализов. Мы произвели первый финский блок TMA в 1999 году. До сих пор в наши ТМА были отобраны до 3000 различных опухолей головного мозга, из которых 2000 глиом и менингиом используются для этого исследования. Ниже приведены примеры проектов, в которых используется этот метод. Аналогичные стратегии используются в настоящем исследовании:

1. Мы изучили взаимосвязь между карбоангидразами и опухолями головного мозга. Карбоангидраза IX (CA IX) представляет собой индуцируемый гипоксией фермент, связанный с онкогенезом. Иммунопозитивность CA IX была обнаружена в 80% из 362 астроцитарных глиом, собранных в блоках тканевых микрочипов. Согласно многофакторному анализу выживаемости, интенсивность CA IX была значимым и независимым прогностическим фактором. CA IX является возможным кандидатом для таргетной терапии.

2. Используя метод кДНК-микрочипов, можно анализировать экспрессию нескольких генов рака в одной гибридизации. Метод микрочипов кДНК-CGH одновременно использует метод микрочипов кДНК и сравнительную геномную гибридизацию. Этот метод позволяет нам изучать взаимосвязь между числом копий гена и экспрессией конкретного амплифицированного гена, а также определять с высоким разрешением гены в клеточных линиях, которые амплифицируются и гиперэкспрессируются. Анализ дает более сфокусированную картину взаимосвязи между изменениями числа копий генов и их экспрессией в различных видах опухолей. С помощью этих методов мы обнаружили несколько новых кандидатов в гены рака, которые могут быть вовлечены в патогенез нейробластом. Чтобы убедиться в роли этих генов, мы построили блоки микрочипов ткани нейробластомы и выполнили анализы FISH и IHC с использованием этих ТМА. Нам удалось охарактеризовать область амплификации, которая встречалась почти в половине образцов опухолей пациентов с нейробластомой и была в значительной степени связана с выживаемостью пациентов.

   Микрочипы свежих и замороженных тканей

   Наша команда в отделении патологии предпринимает шаги для подготовки к молекулярно-биологическим и генетическим исследованиям, для которых требуются архивы свежих тканей. С этой целью мы систематически собирали и регистрировали ткань опухоли головного мозга для современных методов диагностики и исследования рака. Обработка, хранение и архивирование опухолевой ткани головного мозга из нейрохирургических операционных залов

   Университетская больница Тампере осуществляется централизованно в лаборатории замороженных тканей отделения патологии. Эта работа ведется с 1992 года, и к настоящему времени собрано более 1000 свежих образцов опухолей. Образец материала используется для точной диагностики опухоли на этапе первичной диагностики (напр. генетический анализ 1p19q LOH олигодендроглиом). Наше новое приложение для замороженных тканей служит нескольким новым методам молекулярной патологии. Мы разработали совершенно новый метод, основанный на методе мгновенной заморозки, и произвели десятки образцов из разных локализаций мозга (матрица замороженного мозга). Ниже приводится один пример проекта, в котором использовался метод замороженных тканей. Аналогичные принципы будут использоваться в настоящем исследовании:

3. Нами разработан новый метод, облегчающий дифференциальную диагностику опухолей головного мозга во время операции. Используя метод ультрабыстрого окрашивания Ki-67, маркер пролиферации Ki-67 можно проанализировать интраоперационно с помощью метода мгновенной заморозки и световой микроскопии в течение 10–15 минут. Мы смогли убедиться в применимости метода, используя замороженные срезы тканей глиом, которые ранее были собраны в наш банк тканей. На основании индексов пролиферации глиомы можно разделить на разные степени злокачественности и группы прогноза. Этот высокоспецифичный метод диагностики можно применять, например, в ситуациях, когда терапевтические препараты помещаются в интракраниальное операционное поле.

   Экстрагированная РНК и ДНК

   Наша лаборатория хорошо оборудована и подготовлена ​​для исследований РНК и ДНК. После экстракции РНК и ДНК архивируются и хранятся при температуре -700°C для дальнейшего использования. Пример проектов, использующих этот метод:

4. Анализ сцепления предлагает мощный инструмент для локализации генов, которые предрасполагают к семейным заболеваниям, при условии, что имеется достаточное количество семей с данным заболеванием. Для анализа сцепления полиморфные области генома исследуются с использованием маркеров хромосомных областей, которые были переданы от родителей-основателей семьи всем членам семьи с глиомами. Мы собрали образцы крови и ДНК из очень редких семейств глиом (всего 183 члена) для целей анализа сцепления. На основе полногеномного анализа сцепления мы обнаружили новый хромосомный локус, достоверно ассоциированный с семейной глиомой. Следующим этапом нашего исследования является глубокое секвенирование образцов пациентов с семейной глиомой.

Сбор данных

Наш нейроонкологический материал в отделении патологии университетской больницы Тампере включает 5000 образцов тканей (4000 образцов парафина и 1000 образцов замороженных тканей). Это слишком большой набор данных, чтобы отдельные исследователи могли управлять им в своих собственных базах данных. Поэтому наша цель — разработать новую интегрированную систему данных исследований для эффективного управления тканевым материалом, собранным за последние 30 лет, включая подробный реестр всех образцов. Реестр также будет включать цифровые фотоматериалы из ТМА и других гистологических препаратов, а также виртуальные препараты для микроскопии. Соответствующие клинические данные пациентов (например, не менее трех лет наблюдения за пациентами с глиомой и менингиомой, прооперированными в период с 1983 по 2009 год) объединяются с данными о тканях с разрешения властей Финляндии и университетской больницы Тампере.

Проект соблюдает Хельсинкскую декларацию, действующее финское законодательство и принципы защиты данных, установленные Университетской клиникой Тампере. Это исследование носит ретроспективный и чисто наблюдательный характер. Назначение медицинского вмешательства не зависит от усмотрения следователя. Сбор образцов для исследовательских целей требовал информированного согласия каждого отдельного пациента в исследовании семейной глиомы. Архивирование диагностического материала в банке тканей не связано с этическими проблемами. Только лишний материал из диагностических образцов используется в исследовательских целях либо с информированного согласия пациента, либо с разрешения соответствующих финских властей (Национального управления по судебно-медицинским вопросам Финляндии). Этический комитет университетской больницы Тампере дал разрешение на наш проект (R07042). Исследование семейной глиомы проводится по отдельному разрешению (Министерство социальных дел и здравоохранения, Дневник № 127/08/95). Разрешения на исследования также были получены на основании финского закона о тканях (Valvira: дневник № 7796/05.01.00.06/2011).