L'étiologie et la progression des tumeurs cérébrales

Objectifs de l'étude :

1. Collecter du matériel tissulaire de cancer du cerveau adéquat pour des analyses morphologiques, protéiques, ARN et ADN à haut débit.
2. Combiner les résultats tissulaires de ces analyses avec des données cliniques pour examiner le potentiel des nouveaux biomarqueurs pour évaluer le diagnostic, le pronostic et l'hérédité des tumeurs cérébrales.

Matériels et méthodes

Matériau tumoral inclus en paraffine

Des blocs de paraffine de plus de 4 000 tumeurs cérébrales ont été collectés dans le laboratoire de pathologie de l'hôpital universitaire de Tampere (département de pathologie du laboratoire Fimlab). Ils ont été utilisés principalement à des fins de diagnostic clinique, mais une fois que le consentement du patient ou de l'autorité a été obtenu, le surplus de matériel peut être utilisé à des fins de recherche. Un neuropathologiste a marqué la région la plus représentative de chaque tumeur dans une lame de tissu. En utilisant ces marquages, les régions de tissu tumoral sont ensuite biopsiées dans le bloc de microréseau tissulaire (Micro-Array Technology, Beecher Instruments, Inc.). Jusqu'à 1 000 échantillons histologiques peuvent être collectés dans un bloc de microréseau tissulaire, qui peut être découpé en 200 sections de tissu. Ces coupes peuvent être utilisées dans différents types d'analyses (immunohistochimie, hybridation in situ de fluorescence et de chromogène et autres relevés histologiques). Parmi les avantages de la méthode figurent sa grande capacité, son potentiel d'automatisation, ses dommages limités au bloc de tissu d'origine et ses circonstances optimisées pour les analyses de biologie moléculaire. Nous avons produit le premier bloc TMA finlandais en 1999. Jusqu'à présent, jusqu'à 3000 tumeurs cérébrales différentes ont été prélevées dans nos TMA, dont 2000 gliomes et méningiomes sont utilisés pour cette étude. Voici des exemples de projets dans lesquels la méthode est utilisée. Des stratégies similaires sont utilisées dans la présente étude :

1. Nous avons étudié la relation entre les anhydrases carboniques et les tumeurs cérébrales. L'anhydrase carbonique IX (CA IX) est une enzyme induite par l'hypoxie qui est associée à la tumorigenèse. L'immunopositivité CA IX a été trouvée dans 80% des 362 gliomes astrocytaires collectés dans des blocs de microréseaux tissulaires. Selon l'analyse de survie multifactorielle, l'intensité du CA IX était un facteur pronostique significatif et indépendant. CA IX est un candidat possible pour une thérapie ciblée.

2. En utilisant la méthode des puces à ADNc, il est possible d'analyser l'expression de plusieurs gènes du cancer en une seule hybridation. La méthode des puces à ADNc-CGH utilise simultanément la méthode des puces à ADNc et l'hybridation génomique comparative. Cette méthode nous permet d'étudier la relation entre le nombre de copies du gène et l'expression du gène amplifié particulier, et également de définir, à haute résolution, les gènes dans les lignées cellulaires qui sont amplifiés et surexprimés. L'analyse donne une image plus ciblée de la relation entre les changements dans le nombre de copies de gènes et leur expression dans différents types de tumeurs. Grâce à ces méthodes, nous avons trouvé plusieurs nouveaux gènes candidats du cancer qui pourraient être impliqués dans la pathogenèse des neuroblastomes. Pour garantir le rôle de ces gènes, nous avons construit des blocs de microréseaux de tissus de neuroblastome et effectué des analyses FISH et IHC à l'aide de ces TMA. Nous avons réussi à caractériser une région d'amplification présente dans près de la moitié des échantillons de tumeurs de patients atteints de neuroblastome et qui était significativement associée à la survie des patients.

   Microréseaux de tissus frais et de tissus congelés

   Notre équipe du Département de pathologie a pris des mesures pour se préparer aux études de biologie moléculaire et de génétique qui nécessitent des archives de tissus frais. À cette fin, nous avons systématiquement collecté et enregistré des tissus de tumeurs cérébrales pour les méthodes modernes de diagnostic et de recherche sur le cancer. Le traitement, le stockage et l'archivage des tissus tumoraux cérébraux provenant des blocs opératoires neurochirurgicaux de

   L'hôpital universitaire de Tampere est effectué de manière centralisée au laboratoire de tissus congelés du département de pathologie. Ce travail est en cours depuis 1992 et à ce jour, plus de 1 000 échantillons de tumeurs fraîches ont été collectés. Le matériau de l'échantillon est utilisé pour le diagnostic exact de la tumeur dans la phase de diagnostic primaire (par ex. analyse génétique 1p19q LOH des oligodendrogliomes). Notre nouvelle application de tissus congelés sert plusieurs nouvelles méthodes pathologiques moléculaires. Nous avons développé une toute nouvelle méthode basée sur la technique de la congélation rapide et produit des dizaines d'échantillons provenant de différentes localisations cérébrales (frozen brain array). Voici un exemple de projet dans lequel la méthode des tissus congelés a été utilisée. Des principes similaires doivent être utilisés dans la présente étude :

3. Nous avons développé une nouvelle méthode qui facilite le diagnostic différentiel des tumeurs cérébrales pendant l'opération. En utilisant la méthode de coloration Ultrarapid Ki-67, le marqueur de prolifération Ki-67 peut être analysé en peropératoire avec la technique de congélation rapide et la microscopie optique en 10 à 15 minutes. Nous avons pu vérifier l'applicabilité de la méthode en utilisant des coupes de tissus congelés de gliomes qui avaient été précédemment collectés dans notre banque de tissus. Sur la base de leurs indices de prolifération, les gliomes pourraient être divisés en différents grades de malignité et groupes de pronostic. Cette méthode de diagnostic hautement spécifique peut être appliquée par exemple dans des situations où des médicaments thérapeutiques sont placés dans un champ opératoire intracrânien.

   ARN et ADN extraits

   Notre laboratoire est bien équipé et préparé pour les études d'ARN et d'ADN. Après extraction, l'ARN et l'ADN sont archivés et conservés à -700 C pour une utilisation ultérieure. Exemple de projets utilisant cette méthode :

4. L'analyse de liaison offre un outil puissant pour localiser les gènes qui prédisposent aux maladies familiales, à condition qu'il y ait un nombre suffisant de familles atteintes de la maladie concernée. Pour l'analyse de liaison, les régions polymorphes du génome sont étudiées à l'aide de marqueurs de régions chromosomiques qui ont été transmises des parents fondateurs de la famille à tous les membres atteints de gliomes dans la famille. Nous avons recueilli des échantillons de sang et d'ADN de familles de gliomes très rares (avec un total de 183 membres) à des fins d'analyse de liaison. Sur la base d'une analyse de liaison à l'échelle du génome, nous avons trouvé un nouveau locus chromosomique significativement associé au gliome familial. Le séquençage en profondeur des échantillons de patients atteints de gliome familial est l'étape suivante de notre étude.

Collecte de données

Notre matériel neuro-oncologique au département de pathologie de l'hôpital universitaire de Tampere comprend 5 000 échantillons de tissus (4 000 échantillons de paraffine et 1 000 échantillons de tissus congelés). Il s'agit d'un ensemble de données trop volumineux pour être géré par des chercheurs individuels dans leurs propres bases de données. Notre objectif est donc de développer un nouveau système intégré de données de recherche pour une gestion efficace du matériel tissulaire collecté au cours des 30 dernières années, comprenant un registre détaillé de tous les échantillons. Le registre comprendra également du matériel photographique numérique de TMA et d'autres lames histologiques ainsi que des lames de microscopie virtuelle. Les données cliniques pertinentes des patients (par exemple, un suivi d'au moins trois ans des patients atteints de gliome et de méningiome opérés entre 1983 et 2009) sont combinées avec les données tissulaires avec l'autorisation des autorités finlandaises et de l'hôpital universitaire de Tampere.

Le projet respecte la déclaration d'Helsinki, la législation finlandaise en vigueur et les principes de protection des données, établis par l'hôpital universitaire de Tampere. Cette étude est rétrospective et purement observationnelle. L'attribution de l'intervention médicale n'est pas à la discrétion de l'investigateur. La collecte d'échantillons à des fins de recherche nécessitait le consentement éclairé de chaque patient dans l'étude sur le gliome familial. L'archivage de matériel de diagnostic dans une banque de tissus ne pose aucun problème éthique. Seul le matériel excédentaire des échantillons de diagnostic est utilisé à des fins de recherche, soit avec le consentement éclairé du patient, soit avec l'autorisation des autorités finlandaises compétentes (l'Autorité nationale des affaires médico-légales de Finlande). Le comité d'éthique de l'hôpital universitaire de Tampere a donné son autorisation pour notre projet (R07042). L'étude sur le gliome familial est menée dans le cadre d'un permis distinct (Ministère des affaires sociales et de la santé, numéro d'agenda 127/08/95). Des permis de recherche ont également été obtenus sur la base de la loi finlandaise sur les tissus (Valvira : Journal numéro 7796/05.01.00.06/2011).