Az agydaganatok etiológiája és progressziója

A tanulmány céljai:

1. Megfelelő agyrák szövetanyag gyűjtése nagy teljesítményű morfológiai, fehérje, RNS és DNS elemzésekhez.
2. Ezen elemzések szövetekre vonatkozó eredményeinek kombinálása klinikai adatokkal, hogy megvizsgáljuk az új biomarkerek potenciálját az agydaganatok diagnózisának, prognózisának és öröklődésének értékelésére.

Anyagok és metódusok

Paraffinba ágyazott daganatos anyag

Több mint 4000 agydaganat paraffin blokkját gyűjtötték be a Tamperei Egyetemi Kórház Patológiai Laboratóriumába (Fimlab Laboratory Patológiai Osztálya). Elsősorban klinikai diagnosztikai célokra használták őket, de a páciens vagy a hatóság beleegyezése után az anyag többletét kutatási célokra lehet felhasználni. Egy neuropatológus minden daganat legreprezentatívabb régióját jelölte meg egy szövetlemezen. Ezeket a jelöléseket használva a tumorszöveti régiókat biopsziával a szöveti microarray blokkba veszik (Micro-Array Technology, Beecher Instruments, Inc.). Egy szöveti microarray blokkba akár 1000 szövettani minta gyűjthető, amely 200 szövetmetszetre vágható. Ezek a metszetek különféle elemzésekhez használhatók (immunhisztokémia, fluoreszcencia és kromogén in situ hibridizáció és egyéb szövettani értékelések). A módszer előnyei között szerepel a nagy kapacitás, az automatizálás lehetősége, az eredeti szövetblokk korlátozott károsodása és a molekuláris biológiai elemzések optimalizált körülményei. 1999-ben gyártottuk az első finn TMA blokkot. Eddig akár 3000 különböző agydaganatból vettek mintát TMA-inkba: ebből 2000 gliomát és meningiomát használtak fel ehhez a vizsgálathoz. Az alábbiakban példákat mutatunk be azokra a projektekre, amelyekben a módszert használják. Ebben a tanulmányban hasonló stratégiákat használnak:

1. Tanulmányoztuk a karboanhidrázok és az agydaganatok kapcsolatát. A szén-anhidráz IX (CA IX) egy hipoxia által kiváltott enzim, amely a daganatképződéshez kapcsolódik. CA IX immunpozitivitást a szöveti microarray blokkokban gyűjtött 362 asztrocita glióma 80%-ában találtak. A többtényezős túlélési elemzés szerint a CA IX intenzitása szignifikáns és független prognosztikai faktor volt. A CA IX a célzott terápia lehetséges jelöltje.

2. A cDNS-microarray módszer alkalmazásával lehetőség nyílik több rákos gén expressziójának elemzésére egy hibridizáció során. A cDNS-CGH microarray módszer egyidejűleg alkalmazza a cDNS-microarray módszert és az összehasonlító genomiális hibridizációt. Ez a módszer lehetővé teszi számunkra, hogy tanulmányozzuk a génkópiaszám és az adott amplifikált gén expressziója közötti kapcsolatot, valamint nagy felbontásban meghatározzuk azokat a géneket a sejtvonalakban, amelyek amplifikálódnak és túlexpresszálódnak. Az elemzés fókuszáltabb képet ad a génkópiaszám változásai és azok kifejeződése közötti összefüggésről a különböző daganattípusokban. Ezekkel a módszerekkel számos új rákos gén jelöltet találtunk, amelyek szerepet játszhatnak a neuroblasztómák patogenezisében. E gének szerepének biztosítására neuroblasztóma szöveti mikrotömb blokkokat építettünk, és FISH és IHC elemzéseket végeztünk ezekkel a TMA-kkal. Sikerült jellemeznünk egy olyan amplifikációs régiót, amely a neuroblasztómás betegek daganatmintáinak csaknem felében fordult elő, és amely szignifikánsan összefügg a betegek túlélésével.

   Friss szövetek és fagyasztott szövetek mikromátrixai

   A Patológiai Osztályon dolgozó csapatunk lépéseket tett a friss szövetarchívumot igénylő molekuláris biológiai és genetikai vizsgálatok előkészítésére. Ebből a célból szisztematikusan gyűjtöttük és rögzítettük az agydaganatszövetet a rákdiagnosztika és -kutatás modern módszereihez. Az idegsebészeti műtők agydaganatos szöveteinek feldolgozása, tárolása és archiválása a címen

   A Tampere Egyetemi Kórház központilag, a Patológiai Osztály fagyasztott szövet laboratóriumában történik. Ez a munka 1992 óta folyik, és mára több mint 1000 friss daganatmintát gyűjtöttek. A mintaanyagot az elsődleges diagnosztika szakaszában a pontos daganatdiagnosztikára használják (pl. oligodendrogliomák genetikai 1p19q LOH analízise). Újszerű fagyasztott szöveti alkalmazásunk számos új molekuláris patológiai módszert szolgál ki. Kifejlesztettünk egy teljesen új módszert a snap frozen technikán, és több tucat mintát állítottunk elő különböző agyi lokalizációból (fagyasztott agytömb). Az alábbiakban bemutatunk egy példát egy olyan projektre, amelyben fagyasztott szövet módszert alkalmaztak. Hasonló elveket kell alkalmazni a jelen tanulmányban:

3. Új módszert fejlesztettünk ki, amely megkönnyíti az agydaganatok műtét közbeni differenciáldiagnózisát. Az Ultrarapid Ki-67 festési módszerrel a Ki-67 proliferációs marker intraoperatívan elemezhető snap frozen technikával és fénymikroszkóppal 10-15 percen belül. A módszer alkalmazhatóságáról szövetbankunkba gyűjtött gliómák fagyasztott szövetmetszete segítségével tudtunk meggyőződni. A gliomák proliferációs mutatói alapján különböző malignitási fokozatokba és prognózisú csoportokba sorolhatók. Ez a rendkívül specifikus diagnosztikai módszer alkalmazható például olyan helyzetekben, amikor a terápiás gyógyszereket koponyán belüli műtéti mezőbe helyezik.

   Kivont RNS és DNS

   Laboratóriumunk jól felszerelt és felkészült az RNS és DNS vizsgálatokra. Az extrakciót követően az RNS-t és a DNS-t archiváljuk, és -700 C-on tároljuk későbbi felhasználás céljából. Példa projektekre, amelyek ezt a módszert használják:

4. A kapcsolatelemzés hatékony eszközt kínál a családi betegségekre hajlamosító gének lokalizálására, feltéve, hogy elegendő számú család van érintett betegségben. Kapcsolódási analízishez a genom polimorf régióit olyan kromoszómális régiók markereinek felhasználásával vizsgálják, amelyeket a család alapító szülei a család minden gliómában szenvedő tagjának továbbítottak. Vér- és DNS-mintákat gyűjtöttünk nagyon ritka gliómacsaládokból (összesen 183 taggal) kapcsolatelemzés céljából. Az egész genomra kiterjedő kapcsolódási analízis alapján új kromoszómalókuszt találtunk, amely szignifikánsan összefügg a familiáris gliomával. A familiáris gliómás betegek mintáinak mély szekvenálása vizsgálatunk következő lépése.

Adatgyűjtés

A Tamperei Egyetemi Kórház Patológiai Osztályán található neuro-onkológiai anyagunk 5000 szövetmintát tartalmaz (4000 paraffinos és 1000 fagyasztott szövetmintát). Ez túl nagy adatkészlet ahhoz, hogy az egyes kutatók saját adatbázisaikban kezelhessék. Célunk ezért az elmúlt 30 év során gyűjtött szövetanyag hatékony kezelésére szolgáló új, integrált kutatási adatrendszer kidolgozása, amely tartalmazza az összes minta részletes nyilvántartását. A regiszter tartalmazni fogja a TMA digitális fotóanyagát és más szövettani lemezeket, valamint a virtuális mikroszkópos tárgylemezeket is. A betegek releváns klinikai adatait (pl. az 1983-2009 között operált gliómás és meningiomás betegek legalább három éves követése) a finn hatóságok és a tamperei egyetemi kórház engedélyével kombinálják a szöveti adatokkal.

A projekt betartja a Helsinki Nyilatkozatot, a hatályos finn jogszabályokat és a Tampere Egyetemi Kórház által lefektetett adatvédelmi elveket. Ez a tanulmány retrospektív és pusztán megfigyelési jellegű. Az orvosi beavatkozás kijelölése nem a vizsgáló döntése. A kutatási célú minták gyűjtése minden egyes páciens beleegyezését követelte a családi glióma vizsgálatban. A diagnosztikai anyagok szövetbankban történő archiválása nem jár etikai problémákkal. Csak a diagnosztikai minták többletanyagát használják fel kutatási célokra, akár a páciens beleegyezésével, akár az illetékes finn hatóságok (Finnországi Orvosi Jogi Ügyek Nemzeti Hatósága) engedélyével. A Tampere Egyetemi Kórház Etikai Bizottsága engedélyt adott projektünkre (R07042). A családi glióma vizsgálata külön engedély alapján történik (Szociális és Egészségügyi Minisztérium, Napló száma 127/08/95). A kutatási engedélyeket a finn szövettörvény alapján is megszerezték (Valvira: naplószám: 7796/05.01.00.06/2011).