Epänormaalin T-soluaktivaation ja erilaistumisen keskeiset mekanismit IgG4:ään liittyvissä silmäsairauksissa

Immunoglobuliini-G4:ään liittyvä sairaus (IgG4-RD) on äskettäin määritelty immuunivälitteinen krooninen tulehdussairaus, johon liittyy fibroosia, jolle on tunnusomaista lymfoplasmasyyttinen infiltraatio, joka koostuu pääasiassa IgG4+ -plasmasoluista, sekä storiforminen fibroosi, obliteroiva flebiitti ja eosinofiilien infiltraatio. IgG4-RD:n yleisimpiä kliinisiä ilmenemismuotoja ovat merkittävästi kohonneet seerumin IgG4-tasot ja massamaiset leesiot, jotka voivat vaikuttaa lähes mihin tahansa kehon osaan, mikä johtaa puristumiseen ja peruuttamattomiin vaurioihin sairastuneissa elimissä ja ympäröivissä kudoksissa, mikä saattaa johtaa elinten vajaatoimintaan. Huolimatta raporteista, joiden mukaan IgG4-RD:n esiintyvyys on (0,28-1,08)/100 000, todellinen esiintyvyys saattaa olla korkeampi sen äskettäisen määritelmän, kliinikkojen ja potilaiden rajallisen tietoisuuden ja sen salakavalan alkamisen vuoksi.

Immunoglobuliini-G4:ään liittyvä silmäsairaus (IgG4-ROD) viittaa IgG4-RD:n massamaisiin leesioihin, joihin liittyy kyynelrauhanen, silmänulkoiset lihakset, supraorbitaalinen hermo, infraorbitaalinen hermo ja muut silmän vaurioihin johtavat silmät. Näistä kyynelrauhasten osallistuminen on yleisin, mikä ilmenee kivuttomana, yksipuolisena tai molemminpuolisena turvotuksena, johon joskus liittyy vierasesinetuntemusta tai epämukavuutta silmissä. Silmänulkoisten lihasten osallistuminen voi ilmetä lihasten suurenemisena, mikä voi aiheuttaa proptoosia, näön hämärtymistä ja diplopiaa vaikeissa tapauksissa. Orbitaalimassaleesiot voivat myös puristaa näköhermoa, mikä johtaa peruuttamattomaan näön menetykseen. Vaikka IgG4-ROD:lle ei tällä hetkellä ole parannuskeinoa, glukokortikoideja käytetään ensilinjan hoitona massamaisiin leesioihin liittyvän tulehduksen ja fibroosin hallitsemiseksi. IgG4-ROD on altis uusiutumiselle, ja vaikka sen uusiutumistiheydestä ei ole tehty tutkimuksia, eri tutkimukset ovat raportoineet IgG4-RD-potilaiden uusiutumistiheydeksi seurannan aikana 24–63 prosenttia. IgG4-ROD:n tarkka etiologia ja patogeneesi jäävät epäselväksi, ja näiden näkökohtien lisäselvitys helpottaisi uusien terapeuttisten kohteiden tunnistamista, vähentäisi uusiutumisen määrää ja mahdollisesti saavuttaisi parantumisen.

Useat tutkimukset IgG4-RD:n eri muodoista viittaavat T-solujen kriittiseen rooliin IgG4-RD:n, mukaan lukien IgG4-ROD:n, patogeneesissä. Ensinnäkin CD4+ T-solut muodostavat suurimman osan tunkeutuvista lymfosyyteistä IgG4-RD:n vaurioissa. Nämä CD4+ T-solut indusoivat B-solujen lisääntymistä ja luokan vaihtoa sytokiinierityksen kautta ja edistävät kudosfibroosia. Lisäksi rituksimabilla hoidetuilla IgG4-RD-potilailla on korkea uusiutumisaste, kun uusiutumisen jälkeiset B-solukloonit laajenevat eri tavalla kuin ennen hoitoa. Tämä todiste tukee voimakkaasti T-solujen keskeistä roolia IgG4-RD:ssä. IgG4-RD:n patogeneesiin liittyvien T-solualapopulaatioiden joukossa T-follikulaariset auttajasolut (Tfh) ja CD4+ sytotoksiset T-lymfosyytit (CD4+ CTL:t) ovat erityisen merkittäviä. Tfh-solut edistävät kohdunulkoisen itukeskuksen muodostumista ja B-soluluokan vaihtoa IgG4+ -plasmasoluiksi IL-21:n erityksen kautta, kun taas CD4+ CTL:t edistävät kudosfibroosia erittämällä TGF-β:ta, IL-1β:ta ja IFN-y:aa. Epänormaalin T-soluaktivaation ja erilaistumisen taustalla olevat mekanismit sekä IgG4-ROD:ssa että muissa IgG4-RD:issä ovat kuitenkin edelleen huonosti ymmärrettyjä.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on tutkia keskeisiä reittejä, jotka liittyvät epänormaaliin T-solujen aktivaatioon ja erilaistumiseen IgG4-ROD:ssa suorittamalla sarja in vitro -kokeita käyttämällä kirurgisia kudosnäytteitä, perifeeristä verta ja kyynelnestettä potilailta, joilla on IgG4-ROD. Nämä kokeet sisältävät RNA-sekvensoinnin (RNA-Seq), entsyymi-immunosorbenttimääritykset (ELISA) ja in vitro solujen yhteisviljelyn. Tavoitteena on tunnistaa kriittiset reitit IgG4-ROD:n patogeneesissä ja selventää niiden rooleja sairausprosessissa, mikä tarjoaa uusia terapeuttisia kohteita IgG4-ROD:n uusiutumisen vähentämiseksi. Tämä tutkimus voi myös tarjota oivalluksia muiden IgG4:ään liittyvien sairauksien mekanismeista ja hoidosta.

Tutkimusväestö

Tässä tutkimuksessa on mukana potilaita Pekingin yliopistollisen kolmannen sairaalan oftalmologian osastolta, mukaan lukien kyynelrauhaskudosnäytteet IgG4-ROD-potilailta (kokeellinen ryhmä) ja potilailta, joilla on kyynelrauhasen ptoosi, joille tehdään kirurginen uudelleenasento (kontrolliryhmä). Sisällyttämis- ja poissulkemiskriteerit ovat seuraavat:

Sisällyttämiskriteerit

Kokeellinen ryhmä: IgG4-ROD-potilaat, joilla on kyynelrauhasen vaikutusta, diagnosoitu vuosien 2014 ja 2020 japanilaisten IgG4-ROD- ja IgG4-RD-kriteerien perusteella:

Kliiniset ja kuvantamisominaisuudet: kyynelrauhasten tyypillinen diffuusi tai paikallinen turvotus tai kyhmymuodostelmat.

Serologinen diagnoosi: Kohonnut seerumin IgG4-pitoisuus (>135 mg/dl).

Histopatologinen diagnoosi (täyttää 2 alla olevista kolmesta kriteeristä):

Tiheä lymfoplasmasyyttinen infiltraatio ja fibroosi. IgG4+-plasmasolu/IgG+-plasmasolusuhde >40 % ja >10 IgG4+-plasmasolua suuritehoista kenttää kohti.

Tyypillinen fibroosi, erityisesti storiform fibroosi tai obliteroiva flebiitti.

Kontrolliryhmä: Potilaat, joilla on kyynelrauhasen ptoosi, jonka patologia ja kliiniset/kuvantamisominaisuudet ovat vahvistaneet ja jotka vaativat kirurgisen uudelleenasennon.

Poissulkemiskriteerit

Muiden autoimmuunisairauksien, kuten Sjögrenin oireyhtymän, systeemisen lupus erythematosuksen tai nivelreuman, esiintyminen.

Kyynelrauhasen patologia, joka viittaa muihin silmätautien sairauksiin, kuten MALT-lymfoomaan tai tulehdukselliseen pseudotumoriin.

Muita poissulkemiskriteereitä ovat mielenterveyden häiriöt, pahanlaatuiset kasvaimet tai mikä tahansa tila, jonka katsotaan sopimattomaksi tutkimukseen osallistumiseen.

Tutkimusmenetelmät

Kliinisen tiedon kerääminen Potilaiden demografiset tiedot, sairaushistoria ja tarvittavat diagnostisten testien tulokset (esim. kuvantaminen, seerumin IgG-tasot) tallennetaan. Silmätutkimukset sisältävät mm. näöntarkkuuden, silmänpaineen, silmän pintasairausindeksin (OSDI), sarveiskalvon fluoreseiinivärjäyksen (CFS), kyynelkalvon hajoamisajan (FBUT) ja Schirmerin testin.

Näytteiden kerääminen Kyynelnestettä (noin 15 ui silmää kohti) kerätään käyttäen kapillaariputkea ja säilytetään -80 °C:ssa. Osa (50-100 mg) leikatusta kyynelrauhaskudoksesta on varattu tätä tutkimusta varten, kun taas loput käytetään patologiseen analyysiin. Verinäytteitä (noin 10 ml) otetaan perifeerisen veren mononukleaarisolujen (PBMC) valmistamiseksi.

Kyynelrauhaskudoksen RNA-sekvenssin bulkkianalyysi Kokonais-RNA uutetaan kyynelrauhaskudoksesta käyttämällä Trizol-menetelmää, minkä jälkeen suoritetaan RNA:n laadun arviointi Agilent-bioanalysaattorilla. cDNA-kirjasto rakennetaan ja sekvensoidaan käyttämällä Illumina-tekniikkaa. Tietojen käsittely sisältää laadunvalvonnan fastp:llä, kohdistuksen HISAT2:lla ja geeniekspression kvantifioinnin featureCountsilla. Differentiaalinen ilmentymisanalyysi suoritetaan käyttämällä DESeq2:ta, ja geenisarjan rikastusanalyysi (GSEA) suoritetaan. Immuunisolukoostumus kudoksessa analysoidaan käyttämällä xCell- ja CIBERSORTx-menetelmiä.

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ELISA-testiä käytetään RNA-Seq-tuloksissa tunnistettujen avainreittien analysointiin käyttämällä erityisiä sarjoja valmistajan ohjeiden mukaisesti.

In vitro -yhteisviljelykokeet In vitro -yhteisviljelyjärjestelmä IgG4-ROD-potilaiden kyynelrauhassoluista ja PBMC:istä muodostetaan simuloimaan kyynelrauhasen immuuni-mikroympäristöä. RNA-Seq- ja ELISA-tulosten perusteella tähän järjestelmään sovelletaan kohdennettuja interventioita. IgG4/IgG1-suhteet supernatantissa toimivat indikaattorina, ja korkeammat arvot viittaavat vahvempiin patogeenisiin vaikutuksiin.