Ключевые механизмы аномальной активации и дифференцировки Т-клеток при IgG4-связанных офтальмологических заболеваниях

Заболевание, связанное с иммуноглобулином G4 (IgG4-RD), представляет собой недавно выявленное иммуноопосредованное хроническое воспалительное заболевание с фиброзом, характеризующееся лимфоплазмоцитарной инфильтрацией, преимущественно состоящей из плазматических клеток IgG4+, а также сториформным фиброзом, облитерирующим флебитом и эозинофильной инфильтрацией. Наиболее распространенные клинические проявления IgG4-RD включают значительно повышенные уровни IgG4 в сыворотке крови и образования в виде образований, которые могут поражать практически любую часть тела, что приводит к сдавлению и необратимому повреждению пораженных органов и окружающих тканей, что потенциально может привести к органной недостаточности. Несмотря на сообщения, согласно которым распространенность IgG4-RD находится в диапазоне (0,28~1,08)/100 000, фактическая распространенность может быть выше из-за его недавнего определения, ограниченной осведомленности среди врачей и пациентов и его незаметного начала.

Офтальмологическое заболевание, связанное с иммуноглобулином G4 (IgG4-ROD), представляет собой IgG4-RD массоподобные поражения, поражающие слезную железу, экстраокулярные мышцы, надглазничный нерв, подглазничный нерв и другие орбитальные структуры, приводящие к поражениям орбиты. Среди них наиболее частым является поражение слезных желез, проявляющееся безболезненным односторонним или двусторонним отеком, иногда сопровождающееся ощущением инородного тела или дискомфортом в глазах. Вовлечение экстраокулярных мышц может проявляться в виде увеличения мышц, потенциально вызывая экзофтальм, нечеткость зрения и диплопию в тяжелых случаях. Массовые образования орбиты также могут сдавливать зрительный нерв, что приводит к необратимой потере зрения. Хотя в настоящее время не существует лечения IgG4-ROD, глюкокортикоиды используются в качестве лечения первой линии для контроля воспаления и фиброза, связанных с новообразованиями. IgG4-ROD склонен к рецидивам, и хотя исследований, посвященных конкретно частоте рецидивов, не проводилось, в различных исследованиях сообщалось о частоте рецидивов у пациентов с IgG4-RD во время наблюдения в диапазоне от 24% до 63%. Точная этиология и патогенез IgG4-ROD остаются неясными, и дальнейшее выяснение этих аспектов будет способствовать выявлению новых терапевтических целей, снижению частоты рецидивов и потенциальному излечению.

Многочисленные исследования различных форм IgG4-RD предполагают критическую роль Т-клеток в патогенезе IgG4-RD, включая IgG4-ROD. Во-первых, CD4+ Т-клетки составляют большинство инфильтрирующих лимфоцитов при поражениях IgG4-RD. Эти CD4+ Т-клетки индуцируют пролиферацию В-клеток и переключение классов посредством секреции цитокинов и способствуют фиброзу тканей. Кроме того, у пациентов с IgG4-RD, получавших ритуксимаб, наблюдалась высокая частота рецидивов, причем пострецидивные клоны B-клеток размножались иначе, чем до лечения. Эти данные убедительно подтверждают центральную роль Т-клеток в IgG4-RD. Среди субпопуляций Т-клеток, участвующих в патогенезе IgG4-RD, особенно выделяются Т-фолликулярные хелперные клетки (Tfh) и CD4+ цитотоксические Т-лимфоциты (CD4+ CTL). Клетки Tfh способствуют формированию эктопического зародышевого центра и переключению класса B-клеток на плазматические клетки IgG4+ посредством секреции IL-21, тогда как CD4+ CTL способствуют фиброзу тканей, секретируя TGF-β, IL-1β и IFN-γ. Однако механизмы, лежащие в основе аномальной активации и дифференцировки Т-клеток как в IgG4-ROD, так и в других IgG4-RD, остаются плохо изученными.

Целью данного исследования является изучение ключевых путей, участвующих в аномальной активации и дифференцировке Т-клеток при IgG4-ROD, путем проведения серии экспериментов in vitro с использованием образцов хирургической ткани, периферической крови и слезной жидкости пациентов с IgG4-ROD. Эти эксперименты включают секвенирование РНК (RNA-Seq), иммуноферментный анализ (ELISA) и совместное культивирование клеток in vitro. Цель состоит в том, чтобы определить критические пути патогенеза IgG4-ROD и уточнить их роль в процессе заболевания, предоставив новые терапевтические цели для снижения частоты рецидивов IgG4-ROD. Это исследование может также дать представление о механизмах и лечении других заболеваний, связанных с IgG4.

Исследуемая популяция

В этом исследовании приняли участие пациенты из отделения офтальмологии Третьей больницы Пекинского университета, включая образцы ткани слезной железы от пациентов с IgG4-ROD (экспериментальная группа) и пациентов с птозом слезной железы, перенесших хирургическое изменение положения (контрольная группа). Критерии включения и исключения следующие:

Критерии включения

Экспериментальная группа: пациенты IgG4-ROD с поражением слезной железы, диагностированные на основании японских критериев 2014 и 2020 годов для IgG4-ROD и IgG4-RD:

Клинико-визуальные особенности: характерная диффузная или локализованная припухлость или узелковые образования слезных желез.

Серологический диагноз: Повышенная концентрация IgG4 в сыворотке крови (>135 мг/дл).

Гистопатологический диагноз (соответствие 2 из 3 приведенных ниже критериев):

Плотная лимфоплазмоцитарная инфильтрация с фиброзом. Соотношение IgG4+ плазматических клеток/IgG+ плазматических клеток >40% и >10 IgG4+ плазматических клеток в поле зрения высокого разрешения.

Характерный фиброз, особенно сториформный фиброз или облитерирующий флебит.

Контрольная группа: пациенты с птозом слезной железы, подтвержденным патологией и клиническими/визуализирующими особенностями, требующими хирургического изменения положения.

Критерии исключения

Наличие других аутоиммунных заболеваний, таких как синдром Шегрена, системная красная волчанка или ревматоидный артрит.

Патология слезных желез, указывающая на другие заболевания глазницы, такие как MALT-лимфома или воспалительная псевдоопухоль.

Другие критерии исключения включают психические расстройства, злокачественные новообразования или любое состояние, которое считается неподходящим для участия в исследовании.

Методы исследования

Сбор клинической информации. Записываются демографические данные пациента, история болезни и необходимые результаты диагностических тестов (например, визуализация, уровни IgG в сыворотке). Обследование глаз включает, среди прочего, остроту зрения, внутриглазное давление, индекс заболевания поверхности глаза (OSDI), окрашивание роговицы флуоресцеином (CFS), время разрыва слезной пленки (FBUT) и тест Ширмера.

Сбор проб Слезную жидкость (около 15 мкл на глаз) собирают с помощью капиллярной трубки и хранят при -80°C. Часть (50-100 мг) ткани удаленной слезной железы оставляют для этого исследования, а остальную часть используют для патологоанатомического анализа. Образцы крови (приблизительно 10 мл) берутся для приготовления мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС).

Массовый анализ РНК-Seq ткани слезной железы. Тотальную РНК экстрагируют из ткани слезной железы с использованием метода Trizol с последующей оценкой качества РНК с помощью биоанализатора Agilent. Библиотека кДНК создается и секвенируется с использованием технологии Illumina. Обработка данных включает контроль качества с помощью fastp, выравнивание с использованием HISAT2 и количественную оценку экспрессии генов с помощью FeatureCounts. Анализ дифференциальной экспрессии проводят с использованием DESeq2 и анализ обогащения набора генов (GSEA). Состав иммунных клеток в ткани анализируется с помощью xCell и CIBERSORTx.

Иммуноферментный анализ (ELISA) ELISA используется для анализа ключевых путей, выявленных в результатах RNA-Seq, с использованием специальных наборов в соответствии с инструкциями производителя.

Эксперименты по совместному культивированию in vitro. Создана система совместного культивирования in vitro клеток слезной железы пациента IgG4-ROD и РВМС для моделирования иммунного микроокружения слезной железы. На основании результатов RNA-Seq и ELISA к этой системе применяются целевые вмешательства. Соотношение IgG4/IgG1 в супернатанте служит индикатором: более высокие значения указывают на более сильные патогенные эффекты.