Principais mecanismos de ativação e diferenciação anormal de células T na doença oftalmológica relacionada a IgG4

A doença relacionada à imunoglobulina G4 (IgG4-RD) é uma doença inflamatória crônica imunomediada recentemente definida com fibrose, caracterizada por infiltração linfoplasmocitária consistindo predominantemente de células plasmáticas IgG4 +, juntamente com fibrose estoriforme, flebite obliterante e infiltração de eosinófilos. As manifestações clínicas mais comuns de IgG4-RD incluem níveis séricos de IgG4 significativamente elevados e lesões semelhantes a massa, que podem afetar quase qualquer parte do corpo, levando à compressão e danos irreversíveis aos órgãos afetados e tecidos circundantes, resultando potencialmente em falência de órgãos. Apesar dos relatórios estimarem a prevalência de IgG4-RD entre (0,28~1,08)/100.000, a prevalência real pode ser mais elevada devido à sua definição recente, à consciência limitada entre médicos e pacientes e ao seu início insidioso.

A doença oftálmica relacionada à imunoglobulina G4 (IgG4-ROD) refere-se a lesões semelhantes a massa de IgG4-RD envolvendo a glândula lacrimal, músculos extraoculares, nervo supraorbital, nervo infraorbital e outras estruturas orbitais, levando a lesões orbitais. Dentre estes, o envolvimento da glândula lacrimal é o mais comum, manifestando-se como inchaço indolor, unilateral ou bilateral, às vezes acompanhado de sensação de corpo estranho ou desconforto ocular. O envolvimento muscular extraocular pode se manifestar como aumento muscular, podendo causar proptose, visão turva e diplopia em casos graves. Lesões de massa orbital também podem comprimir o nervo óptico, levando à perda irreversível da visão. Embora atualmente não haja cura para o IgG4-ROD, os glicocorticóides são usados ​​como tratamento de primeira linha para controlar a inflamação e a fibrose associadas às lesões semelhantes a massa. O IgG4-ROD é propenso a recidiva e, embora não existam estudos específicos sobre sua taxa de recorrência, diferentes estudos relataram taxas de recidiva de pacientes com IgG4-RD durante o acompanhamento variando de 24% a 63%. A etiologia exata e a patogênese da IgG4-ROD permanecem obscuras, e uma maior elucidação desses aspectos facilitaria a identificação de novos alvos terapêuticos, reduziria as taxas de recaída e potencialmente alcançaria a cura.

Vários estudos sobre várias formas de IgG4-RD sugerem um papel crítico das células T na patogênese da IgG4-RD, incluindo IgG4-ROD. Primeiro, as células T CD4+ constituem a maioria dos linfócitos infiltrantes nas lesões de IgG4-RD. Estas células T CD4+ induzem a proliferação de células B e a mudança de classe através da secreção de citocinas e contribuem para a fibrose tecidual. Além disso, os pacientes com IgG4-RD tratados com rituximab apresentam altas taxas de recaída, com clones de células B pós-recaída expandindo-se de forma diferente em comparação com o pré-tratamento. Esta evidência apoia fortemente o papel central das células T na IgG4-RD. Entre as subpopulações de células T implicadas na patogênese de IgG4-RD, as células T auxiliares foliculares (Tfh) e os linfócitos T citotóxicos CD4+ (CTLs CD4+) são particularmente notáveis. As células Tfh promovem a formação de centro germinativo ectópico e a mudança de classe de células B para células plasmáticas IgG4+ através da secreção de IL-21, enquanto os CTLs CD4+ contribuem para a fibrose tecidual pela secreção de TGF-β, IL-1β e IFN-γ. No entanto, os mecanismos subjacentes à ativação e diferenciação anormais de células T tanto em IgG4-ROD como em outras IgG4-RD permanecem pouco compreendidos.

Este estudo tem como objetivo investigar as principais vias envolvidas na ativação e diferenciação anormal de células T em IgG4-ROD, conduzindo uma série de experimentos in vitro usando amostras de tecido cirúrgico, sangue periférico e fluido lacrimal de pacientes com IgG4-ROD. Esses experimentos incluem sequenciamento de RNA (RNA-Seq), ensaios imunoenzimáticos (ELISA) e cocultura de células in vitro. O objetivo é identificar vias críticas na patogênese da IgG4-ROD e esclarecer seus papéis no processo da doença, fornecendo novos alvos terapêuticos para reduzir a taxa de recorrência da IgG4-ROD. Esta pesquisa também pode oferecer insights sobre os mecanismos e o tratamento de outras doenças relacionadas à IgG4.

População do Estudo

Este estudo envolve pacientes do Departamento de Oftalmologia do Terceiro Hospital da Universidade de Pequim, incluindo amostras de tecido da glândula lacrimal de pacientes IgG4-ROD (grupo experimental) e pacientes com ptose da glândula lacrimal submetidos a reposicionamento cirúrgico (grupo controle). Os critérios de inclusão e exclusão são os seguintes:

Critérios de inclusão

Grupo Experimental: Pacientes IgG4-ROD com envolvimento da glândula lacrimal, diagnosticados com base nos critérios japoneses de 2014 e 2020 para IgG4-ROD e IgG4-RD:

Características clínicas e de imagem: inchaço característico difuso ou localizado ou formações nodulares das glândulas lacrimais.

Diagnóstico sorológico: Concentração sérica elevada de IgG4 (>135 mg/dL).

Diagnóstico histopatológico (atendendo a 2 dos 3 critérios abaixo):

Infiltração linfoplasmocitária densa com fibrose. Proporção de células plasmáticas IgG4+/células plasmáticas IgG+ >40% e >10 células plasmáticas IgG4+ por campo de alta potência.

Fibrose característica, especialmente fibrose estoriforme ou flebite obliterante.

Grupo Controle: Pacientes com ptose da glândula lacrimal confirmada por patologia e características clínicas/imagem, necessitando de reposicionamento cirúrgico.

Critérios de exclusão

Presença de outras doenças autoimunes como síndrome de Sjögren, lúpus eritematoso sistêmico ou artrite reumatóide.

Patologia da glândula lacrimal indicando outras doenças orbitais, como linfoma MALT ou pseudotumor inflamatório.

Outros critérios de exclusão incluem transtornos mentais, doenças malignas ou qualquer condição considerada inadequada para participação no estudo.

Métodos de estudo

Coleta de informações clínicas São registrados dados demográficos do paciente, histórico médico e resultados de testes de diagnóstico necessários (por exemplo, imagens, níveis séricos de IgG). Os exames oculares incluem acuidade visual, pressão intraocular, Índice de Doenças da Superfície Ocular (OSDI), coloração com fluoresceína da córnea (CFS), tempo de ruptura do filme lacrimal (FBUT) e teste de Schirmer, entre outros.

Coleta de Amostras O fluido lacrimal (cerca de 15 µL por olho) é coletado usando um tubo capilar e armazenado a -80°C. Uma porção (50-100 mg) do tecido da glândula lacrimal ressecado é reservada para este estudo, enquanto o restante é utilizado para análise patológica. Amostras de sangue (aproximadamente 10 mL) são coletadas para preparar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs).

Análise de RNA-Seq em massa do tecido da glândula lacrimal O RNA total é extraído do tecido da glândula lacrimal usando o método Trizol, seguido pela avaliação da qualidade do RNA com um bioanalisador Agilent. Uma biblioteca de cDNA é construída e sequenciada usando a tecnologia Illumina. O processamento de dados inclui controle de qualidade com fastp, alinhamento usando HISAT2 e quantificação de expressão gênica com featureCounts. A análise de expressão diferencial é realizada usando DESeq2, e a Análise de Enriquecimento de Conjunto de Genes (GSEA) é conduzida. A composição das células imunológicas no tecido é analisada usando xCell e CIBERSORTx.

Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) O ELISA é usado para analisar as principais vias identificadas nos resultados de RNA-Seq, usando kits específicos de acordo com as instruções do fabricante.

Experimentos de co-cultura in vitro Um sistema de co-cultura in vitro de células da glândula lacrimal de paciente IgG4-ROD e PBMCs é estabelecido para simular o microambiente imunológico da glândula lacrimal. Com base nos resultados de RNA-Seq e ELISA, intervenções direcionadas são aplicadas a este sistema. As proporções IgG4/IgG1 no sobrenadante servem como um indicador, com valores mais elevados sugerindo efeitos patogénicos mais fortes.