Kluczowe mechanizmy nieprawidłowej aktywacji i różnicowania limfocytów T w chorobie okulistycznej związanej z IgG4

Choroba związana z immunoglobuliną G4 (IgG4-RD) to nowo zdefiniowana przewlekła choroba zapalna o podłożu immunologicznym ze zwłóknieniem, charakteryzująca się naciekiem limfoplazmatycznym składającym się głównie z komórek plazmatycznych IgG4+, wraz ze zwłóknieniem piętrowym, zarostowym zapaleniem żył i naciekiem eozynofili. Do najczęstszych objawów klinicznych IgG4-RD należą znacznie podwyższone poziomy IgG4 w surowicy oraz zmiany masowe, które mogą dotyczyć niemal każdej części ciała, prowadząc do ucisku i nieodwracalnego uszkodzenia zajętych narządów i otaczających tkanek, co może skutkować niewydolnością narządu. Pomimo doniesień szacujących częstość występowania IgG4-RD na (0,28–1,08)/100 000, faktyczna częstość występowania może być wyższa ze względu na najnowszą definicję, ograniczoną świadomość wśród klinicystów i pacjentów oraz jej podstępny początek.

Choroba oczna związana z immunoglobuliną G4 (IgG4-ROD) odnosi się do masowych zmian IgG4-RD obejmujących gruczoł łzowy, mięśnie zewnątrzgałkowe, nerw nadoczodołowy, nerw podoczodołowy i inne struktury oczodołu, prowadzące do uszkodzeń oczodołu. Wśród nich najczęstsze jest zajęcie gruczołów łzowych, objawiające się bezbolesnym, jednostronnym lub obustronnym obrzękiem, któremu czasami towarzyszy uczucie ciała obcego lub dyskomfort w oku. Zajęcie mięśni zewnątrzgałkowych może objawiać się powiększeniem mięśni, co może powodować wytrzeszcz, niewyraźne widzenie i podwójne widzenie w ciężkich przypadkach. Zmiany masy oczodołowej mogą również uciskać nerw wzrokowy, prowadząc do nieodwracalnej utraty wzroku. Chociaż obecnie nie ma leku na IgG4-ROD, glukokortykoidy stosuje się jako leczenie pierwszego rzutu w celu kontrolowania stanu zapalnego i zwłóknienia związanego ze zmianami masowymi. IgG4-ROD jest podatna na nawroty i chociaż nie ma badań dotyczących konkretnie częstości nawrotów, w różnych badaniach wykazano, że częstość nawrotów u pacjentów z IgG4-RD w okresie obserwacji waha się od 24% do 63%. Dokładna etiologia i patogeneza IgG4-ROD pozostają niejasne, a dalsze wyjaśnienie tych aspektów ułatwiłoby identyfikację nowych celów terapeutycznych, zmniejszenie częstości nawrotów i potencjalnie osiągnięcie wyleczenia.

Liczne badania różnych form IgG4-RD sugerują kluczową rolę limfocytów T w patogenezie IgG4-RD, w tym IgG4-ROD. Po pierwsze, limfocyty T CD4+ stanowią większość limfocytów naciekających zmiany chorobowe IgG4-RD. Te limfocyty T CD4+ indukują proliferację komórek B i przełączanie klas poprzez wydzielanie cytokin i przyczyniają się do zwłóknienia tkanek. Ponadto pacjenci z IgG4-RD leczeni rytuksymabem wykazują wysoki wskaźnik nawrotów, a klony komórek B po nawrocie namnażają się inaczej w porównaniu do stanu przed leczeniem. Dowody te silnie potwierdzają centralną rolę limfocytów T w IgG4-RD. Wśród subpopulacji komórek T zaangażowanych w patogenezę IgG4-RD, szczególnie godne uwagi są komórki pomocnicze T pęcherzyków T (Tfh) i cytotoksyczne limfocyty T CD4+ (CD4+ CTL). Komórki Tfh promują ektopowe tworzenie ośrodków rozrodczych i przełączanie klas komórek B do komórek plazmatycznych IgG4+ poprzez wydzielanie IL-21, podczas gdy CTL CD4+ przyczyniają się do zwłóknienia tkanek poprzez wydzielanie TGF-β, IL-1β i IFN-γ. Jednakże mechanizmy leżące u podstaw nieprawidłowej aktywacji i różnicowania limfocytów T zarówno w IgG4-ROD, jak i innych IgG4-RD pozostają słabo poznane.

Celem tego badania jest zbadanie kluczowych szlaków zaangażowanych w nieprawidłową aktywację i różnicowanie limfocytów T w IgG4-ROD poprzez przeprowadzenie serii eksperymentów in vitro z wykorzystaniem próbek tkanek chirurgicznych, krwi obwodowej i płynu łzowego od pacjentów z IgG4-ROD. Eksperymenty te obejmują sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq), testy immunoenzymatyczne (ELISA) i wspólną hodowlę komórek in vitro. Celem jest identyfikacja kluczowych szlaków w patogenezie IgG4-ROD i wyjaśnienie ich roli w procesie chorobowym, zapewniając nowe cele terapeutyczne w celu zmniejszenia częstości nawrotów IgG4-ROD. Badania te mogą również dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów i leczenia innych chorób związanych z IgG4.

Badana populacja

W badaniu tym uczestniczyli pacjenci z Oddziału Okulistyki Trzeciego Szpitala Uniwersytetu w Pekinie, w tym próbki tkanki gruczołu łzowego od pacjentów z IgG4-ROD (grupa eksperymentalna) oraz pacjentów z opadaniem gruczołów łzowych poddawanych repozycjonowaniu chirurgicznemu (grupa kontrolna). Kryteria włączenia i wyłączenia są następujące:

Kryteria włączenia

Grupa eksperymentalna: Pacjenci IgG4-ROD z zajęciem gruczołów łzowych, zdiagnozowani na podstawie japońskich kryteriów IgG4-ROD i IgG4-RD z lat 2014 i 2020:

Cechy kliniczne i obrazowe: charakterystyczny rozlany lub zlokalizowany obrzęk lub formacje guzkowe gruczołów łzowych.

Rozpoznanie serologiczne: Podwyższone stężenie IgG4 w surowicy (>135 mg/dL).

Rozpoznanie histopatologiczne (spełniające 2 z 3 poniższych kryteriów):

Gęsty naciek limfoplazmatyczny ze zwłóknieniem. Stosunek komórek plazmatycznych IgG4+/komórek plazmatycznych IgG+ > 40% i > 10 komórek plazmatycznych IgG4+ na pole o dużej mocy.

Charakterystyczne zwłóknienie, szczególnie zwłóknienie piętrowe lub zarostowe zapalenie żył.

Grupa kontrolna: Pacjenci z opadaniem gruczołów łzowych potwierdzonym patologią i cechami klinicznymi/obrazowymi, wymagającymi repozycjonowania chirurgicznego.

Kryteria wykluczenia

Obecność innych chorób autoimmunologicznych, takich jak zespół Sjögrena, toczeń rumieniowaty układowy lub reumatoidalne zapalenie stawów.

Patologia gruczołów łzowych wskazująca na inne choroby oczodołu, takie jak chłoniak MALT lub zapalny guz rzekomy.

Inne kryteria wykluczenia obejmują zaburzenia psychiczne, nowotwory złośliwe lub wszelkie schorzenia uznane za nieodpowiednie do udziału w badaniu.

Metody badania

Gromadzenie informacji klinicznych Rejestrowane są dane demograficzne pacjentów, historia choroby i niezbędne wyniki badań diagnostycznych (np. badania obrazowe, poziomy IgG w surowicy). Badania oka obejmują między innymi ostrość wzroku, ciśnienie wewnątrzgałkowe, wskaźnik choroby powierzchni oka (OSDI), barwienie fluoresceiną rogówki (CFS), czas przerwania filmu łzowego (FBUT) i test Schirmera.

Pobieranie próbek Płyn łzowy (około 15 µl na oko) zbiera się za pomocą rurki kapilarnej i przechowuje w temperaturze -80°C. Część (50-100 mg) usuniętej tkanki gruczołu łzowego jest zarezerwowana do tego badania, a pozostała część służy do analizy patologicznej. Pobiera się próbki krwi (około 10 ml) w celu przygotowania jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC).

Analiza masowej sekwencji RNA tkanki gruczołu łzowego Całkowity RNA ekstrahuje się z tkanki gruczołu łzowego metodą Trizol, a następnie ocenia jakość RNA za pomocą bioanalizatora Agilent. Bibliotekę cDNA konstruuje się i sekwencjonuje przy użyciu technologii Illumina. Przetwarzanie danych obejmuje kontrolę jakości za pomocą fastp, dopasowanie za pomocą HISAT2 i ilościową ocenę ekspresji genów za pomocą funkcji FeatureCounts. Różnicową analizę ekspresji przeprowadza się przy użyciu DESeq2 i przeprowadza się analizę wzbogacania zestawu genów (GSEA). Skład komórek odpornościowych w tkance analizuje się za pomocą xCell i CIBERSORTx.

Test immunoenzymatyczny (ELISA) ELISA służy do analizy kluczowych szlaków zidentyfikowanych w wynikach RNA-Seq przy użyciu specjalnych zestawów zgodnie z instrukcjami producenta.

Eksperymenty z współhodowlą in vitro System wspólnej hodowli in vitro komórek gruczołu łzowego pacjenta IgG4-ROD i PBMC opracowano w celu symulowania mikrośrodowiska immunologicznego gruczołu łzowego. W oparciu o wyniki RNA-Seq i ELISA w tym systemie stosuje się ukierunkowane interwencje. Stosunki IgG4/IgG1 w supernatancie służą jako wskaźnik, przy czym wyższe wartości sugerują silniejsze działanie patogenne.