Meccanismi chiave di attivazione e differenziazione anomala delle cellule T nella malattia oftalmica correlata a IgG4

La malattia correlata alle immunoglobuline G4 (IgG4-RD) è una malattia infiammatoria cronica immunomediata di nuova definizione con fibrosi, caratterizzata da infiltrazione linfoplasmocitaria costituita prevalentemente da plasmacellule IgG4+, insieme a fibrosi storiforme, flebite obliterante e infiltrazione di eosinofili. Le manifestazioni cliniche più comuni di IgG4-RD comprendono livelli sierici di IgG4 significativamente elevati e lesioni simili a masse, che possono colpire quasi ogni parte del corpo, portando a compressione e danno irreversibile agli organi colpiti e ai tessuti circostanti, con conseguente potenziale insufficienza d'organo. Nonostante i rapporti stimino che la prevalenza di IgG4-RD sia compresa tra (0,28~1,08)/100.000, la prevalenza effettiva potrebbe essere più elevata a causa della sua recente definizione, della limitata consapevolezza tra medici e pazienti e della sua insidiosa insorgenza.

La malattia oftalmica correlata all'immunoglobulina-G4 (IgG4-ROD) si riferisce a lesioni simili a masse IgG4-RD che coinvolgono la ghiandola lacrimale, i muscoli extraoculari, il nervo sopraorbitario, il nervo infraorbitario e altre strutture orbitali, che portano a lesioni orbitali. Tra questi, il coinvolgimento delle ghiandole lacrimali è il più comune, manifestandosi come gonfiore indolore, unilaterale o bilaterale, talvolta accompagnato da sensazione di corpo estraneo o fastidio agli occhi. Il coinvolgimento dei muscoli extraoculari può manifestarsi come ingrossamento muscolare, causando potenzialmente proptosi, visione offuscata e diplopia nei casi più gravi. Le lesioni della massa orbitale possono anche comprimere il nervo ottico, portando alla perdita irreversibile della vista. Sebbene attualmente non esista una cura per l’IgG4-ROD, i glucocorticoidi vengono utilizzati come trattamento di prima linea per controllare l’infiammazione e la fibrosi associate alle lesioni simili a masse. IgG4-ROD è soggetto a recidiva e, sebbene non esistano studi specifici sul suo tasso di recidiva, diversi studi hanno riportato tassi di recidiva dei pazienti IgG4-RD durante il follow-up che vanno dal 24% al 63%. L’esatta eziologia e patogenesi dell’IgG4-ROD rimangono poco chiare e un’ulteriore delucidazione di questi aspetti faciliterebbe l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici, ridurrebbe i tassi di recidiva e potenzialmente raggiungerebbe una cura.

Numerosi studi su varie forme di IgG4-RD suggeriscono un ruolo critico delle cellule T nella patogenesi di IgG4-RD, incluso IgG4-ROD. Innanzitutto, le cellule T CD4+ costituiscono la maggior parte dei linfociti infiltranti nelle lesioni IgG4-RD. Queste cellule T CD4+ inducono la proliferazione delle cellule B e il cambio di classe attraverso la secrezione di citochine e contribuiscono alla fibrosi dei tessuti. Inoltre, i pazienti IgG4-RD trattati con rituximab mostrano tassi elevati di recidiva, con cloni di cellule B post-recidiva che si espandono in modo diverso rispetto al pre-trattamento. Questa evidenza supporta fortemente il ruolo centrale delle cellule T nell'IgG4-RD. Tra le sottopopolazioni di cellule T implicate nella patogenesi delle IgG4-RD, le cellule T helper follicolari (Tfh) e i linfociti T citotossici CD4+ (CTL CD4+) sono particolarmente notevoli. Le cellule Tfh promuovono la formazione ectopica del centro germinale e il passaggio di classe delle cellule B alle plasmacellule IgG4+ attraverso la secrezione di IL-21, mentre i CTL CD4+ contribuiscono alla fibrosi tissutale secernendo TGF-β, IL-1β e IFN-γ. Tuttavia, i meccanismi alla base dell'attivazione e della differenziazione anormale delle cellule T sia in IgG4-ROD che in altri IgG4-RD rimangono scarsamente compresi.

Questo studio mira a indagare i percorsi chiave coinvolti nell'attivazione e nella differenziazione anormale delle cellule T nell'IgG4-ROD conducendo una serie di esperimenti in vitro utilizzando campioni di tessuto chirurgico, sangue periferico e liquido lacrimale di pazienti con IgG4-ROD. Questi esperimenti includono il sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq), test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e co-coltura cellulare in vitro. L'obiettivo è identificare i percorsi critici nella patogenesi dell'IgG4-ROD e chiarire il loro ruolo nel processo patologico, fornendo nuovi bersagli terapeutici per ridurre il tasso di recidiva dell'IgG4-ROD. Questa ricerca potrebbe anche offrire approfondimenti sui meccanismi e sul trattamento di altre malattie correlate alle IgG4.

Popolazione dello studio

Questo studio coinvolge pazienti del Dipartimento di Oftalmologia del Terzo Ospedale dell'Università di Pechino, inclusi campioni di tessuto delle ghiandole lacrimali provenienti da pazienti IgG4-ROD (gruppo sperimentale) e pazienti con ptosi delle ghiandole lacrimali sottoposti a riposizionamento chirurgico (gruppo di controllo). I criteri di inclusione ed esclusione sono i seguenti:

Criteri di inclusione

Gruppo sperimentale: pazienti IgG4-ROD con coinvolgimento delle ghiandole lacrimali, diagnosticati sulla base dei criteri giapponesi 2014 e 2020 per IgG4-ROD e IgG4-RD:

Caratteristiche cliniche e di imaging: caratteristico gonfiore diffuso o localizzato o formazioni nodulari delle ghiandole lacrimali.

Diagnosi sierologica: elevata concentrazione sierica di IgG4 (>135 mg/dL).

Diagnosi istopatologica (che soddisfa 2 dei 3 criteri seguenti):

Infiltrazione linfoplasmocitica densa con fibrosi. Rapporto plasmacellule IgG4+/plasmacellule IgG+ >40% e >10 plasmacellule IgG4+ per campo ad alta potenza.

Fibrosi caratteristica, in particolare fibrosi storiforme o flebite obliterante.

Gruppo di controllo: pazienti con ptosi della ghiandola lacrimale confermata dalla patologia e dalle caratteristiche cliniche/di imaging, che richiedono un riposizionamento chirurgico.

Criteri di esclusione

Presenza di altre malattie autoimmuni come la sindrome di Sjögren, il lupus eritematoso sistemico o l'artrite reumatoide.

Patologia delle ghiandole lacrimali che indica altre malattie orbitali come il linfoma MALT o lo pseudotumore infiammatorio.

Altri criteri di esclusione includono disturbi mentali, tumori maligni o qualsiasi condizione ritenuta inadatta alla partecipazione allo studio.

Metodi di studio

Raccolta di informazioni cliniche Vengono registrati i dati demografici del paziente, l'anamnesi medica e i risultati dei test diagnostici necessari (ad esempio, imaging, livelli di IgG nel siero). Gli esami oculari includono l'acuità visiva, la pressione intraoculare, l'indice di malattia della superficie oculare (OSDI), la colorazione corneale con fluoresceina (CFS), il tempo di rottura del film lacrimale (FBUT) e il test di Schirmer, tra gli altri.

Raccolta dei campioni Il liquido lacrimale (circa 15 µl per occhio) viene raccolto utilizzando un tubo capillare e conservato a -80°C. Una porzione (50-100 mg) del tessuto della ghiandola lacrimale asportata è riservata a questo studio, mentre il resto viene utilizzato per l'analisi patologica. Vengono prelevati campioni di sangue (circa 10 ml) per preparare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC).

Analisi RNA-Seq in massa del tessuto della ghiandola lacrimale L'RNA totale viene estratto dal tessuto della ghiandola lacrimale utilizzando il metodo Trizol, seguito dalla valutazione della qualità dell'RNA con un bioanalizzatore Agilent. Una libreria di cDNA viene costruita e sequenziata utilizzando la tecnologia Illumina. L'elaborazione dei dati include il controllo di qualità con fastp, l'allineamento utilizzando HISAT2 e la quantificazione dell'espressione genica con featureCounts. L'analisi dell'espressione differenziale viene eseguita utilizzando DESeq2 e viene condotta l'analisi dell'arricchimento del set di geni (GSEA). La composizione delle cellule immunitarie nel tessuto viene analizzata utilizzando xCell e CIBERSORTx.

Saggio immunoassorbente legato all'enzima (ELISA) ELISA viene utilizzato per analizzare i percorsi chiave identificati nei risultati RNA-Seq, utilizzando kit specifici secondo le istruzioni del produttore.

Esperimenti di co-coltura in vitro Viene creato un sistema di co-coltura in vitro di cellule della ghiandola lacrimale del paziente IgG4-ROD e PBMC per simulare il microambiente immunitario della ghiandola lacrimale. Sulla base dei risultati RNA-Seq ed ELISA, a questo sistema vengono applicati interventi mirati. I rapporti IgG4/IgG1 nel surnatante servono da indicatore, con valori più alti che suggeriscono effetti patogeni più forti.