Közösségi alapú klinikai vizsgálat helyben elérhető élelmiszer-összetevőkből készült mikrobiotára irányított kiegészítő élelmiszerekkel (MDCF-ek) a súlyos akut alultápláltság utáni közepesen súlyos akut alultápláltságban szenvedő gyermekek kezelésére (Post-SAM MAM)

Háttér:

A mérsékelt akut alultápláltság (MAM), amely egy jelentős globális egészségügyi probléma, a pazarlásként (azaz. súly/magasság <-2 és -3 Z-pont között a WHO Gyermeknövekedési Szabványai szerint) és/vagy a felkar középső kerülete (MUAC) legalább 115 mm, de kevesebb, mint 125 mm. A 2017-es Globális Táplálkozási Jelentés szerint 2016-ban világszerte az öt év alatti gyermekek 8%-a, azaz 52 millió volt akut alultápláltság, és 23%-át, azaz 155 millió gyermeket érintett a fejlődésben elmaradó vagy krónikus alultápláltság. Dél-Ázsiában körülbelül minden hatodik 5 év alatti gyermek szenvedett MAM-tól 2013-ban (pl. 17%). Ezek a gyerekek fokozottan ki vannak téve a súlyos akut alultápláltság (SAM) kockázatának, és háromszor nagyobb a közös fertőző betegségek miatti halálozás kockázata, mint a jól táplált társaik. Bangladesben van az egyik legnagyobb gyermekkori alultápláltság a világon. A 2014-es bangladesi demográfiai egészségfelmérés szerint az országban az öt év alatti gyermekek körében 36%, közülük 12% szenved súlyos csökevényesedéstől (LAZ <-3).1 A gyermekek körülbelül 15%-a veszteségbe kerül (súly- for-length, WLZ <-2); több mint 2 millió gyermek szenved MAM-ban, míg 3%-a vagy 450 000 gyermek szenved a SAM halálos formájától. Az alultápláltság évente 1 milliárd dollárba kerül Bangladesnek.

A WHO ajánlásai szerint a 6-59 hónapos MAM-ban szenvedő csecsemőknek és gyermekeknek tápanyagban gazdag ételeket kell fogyasztaniuk, hogy kielégítsék a súly- és magassággyarapodáshoz, valamint a funkcionális helyreállításhoz szükséges extra szükségleteiket. Jelenleg nincsenek bizonyítékokon alapuló ajánlások a MAM-ban szenvedő gyermekek kezelésére használt kiegészítő élelmiszerek összetételére vonatkozóan. Az alultápláltság kezelésére irányuló beavatkozásoknak ezért a MAM kezelésének erős elemét kell tartalmazniuk. A MAM megelőzését figyelembe kell venni az élelmezésbiztonsági és egyéb fejlesztési stratégiákban, mivel a helyzet kritikussá válik azokban a populációkban, ahol az élelmezésbizonytalanság tombol. Ezért fontos olyan, helyben elérhető élelmiszer-összetevőktől függő beavatkozások kidolgozása, amelyek kis mennyiségben képesek kamatoztatni a bélmikrobióta jótékony erejét a csecsemők és gyermekek növekedésében.

A táplálkozási beavatkozások hatását korlátozó egyik fő tényező az, hogy az alultáplált gyermekek nem tudják növelni bevitelüket a megnövekedett anyagcsere-szükségletek kielégítésére. Az icddr,b és a St. Louis-i Washington Egyetem Gordon Laboratóriuma között az anyatej, mikrobiota és immunitás (BMMI) projekt Jumpstart fázisa során végzett együttműködési vizsgálatok során a Random Forests módszert alkalmaztuk bakteriális 16S rRNS (riboszomális ribonukleinsav) adatkészletekre. A bangladesi Dakka városi nyomornegyedében élő gyermekek születési csoportjától származó havi székletmintákból készült. Ezek a gyerekek folyamatosan egészséges növekedést mutattak (WLZ -0,32+0,98). Olyan baktériumtörzseket azonosítottak, amelyek arányos reprezentációja meghatározza az egészséges bélmikrobiótát, amint az a születés utáni első 2-3 évben összeáll. Az icddr,b-nél végzett randomizált klinikai vizsgálatban két terápiás élelmiszerrel (importált, használatra kész terápiás élelmiszer [RUTF, Plumpy'Nut] szemben a helyben elkészített rizs/lencse alapú Khichuri és Halwa) bangladesi gyerekekkel, akik súlyos akut alultápláltságban (SAM) szenvednek. ), megfigyelték, hogy a mikrobiota éretlensége nem teljesen, és csak átmenetileg javult, a gyermekek pedig jelentősen satnya és alulsúlyosak maradtak a követési időszak alatt. A MAM-ban szenvedő bangladesi gyermekek szintén jelentős mikrobiota éretlenséget mutattak, bár kevésbé súlyosak, mint a SAM-ban szenvedő gyermekek. A mikrobiota éretlensége tehát potenciális biomarkerként szolgál az alultápláltság kockázatának kitett csecsemők azonosítására, valamint a kezelési és megelőzési stratégiák nyomon követésére. Korábbi, az ERC által jóváhagyott vizsgálatunkban (PR-09023) a Mirpur nyomornegyedében élő egészséges gyermekek bélmikrobiótáját hasonlítottuk össze súlyos akut alultápláltság miatt kórházba került gyerekekkel. A mikrobiótát 16S riboszómális RNS szekvenálással értékeltük. Azt találtuk, hogy a SAM-ban szenvedő gyermekek bélmikrobiótája kronológiailag elmarad az egészséges gyermekek mikrobiótájától. Például egy kétéves, SAM-ban szenvedő gyermek bélmikrobiótája hasonló lehet egy egyéves egészséges gyermekéhez. Ezt a bél mikrobiota éretlenségének nevezik. Két mérőszámot dolgoztunk ki ennek a bélrendszeri éretlenségnek a reprezentálására: a relatív mikrobiota érettségi indexet és a mikrobiota életkor szerinti Z pontszámát; A SAM jelentős relatív mikrobiota éretlenséggel jár, amely csak részben javul a táplálkozási beavatkozásokat követően. .

A közelmúltban felhasználásra kész terápiás élelmiszereket fejlesztettünk ki helyi élelmiszer-összetevők – rizs, lencse és csicseriborsó – felhasználásával, amelyek kulturális szempontból relevánsak és elfogadhatóak. Egy kettős vak RCT (Randomized Controlled Trial) során azt találtuk, hogy az általunk kifejlesztett bangladesi csicseriborsó alapú és rizslencse alapú RUTF (Ready To Use Therapeutic Food) ugyanolyan hatékony, mint a kereskedelmi forgalomban kapható földimogyoró alapú RUTF, és a gyerekek is jól elfogadták. a SAM-mel. A fent említett RCT és az elmúlt 7-8 év során végzett klinikai transzlációs vizsgálatok kombinációjával azonosítottuk a növekedést serkentő, életkortól megkülönböztető hasznos mikrobiotát és olyan helyben elérhető élelmiszer-összetevőket, amelyek támogatják e jótékony mikrobióta elszaporodását. Emellett a Washingtoni Egyetem Genomtudományi Központjában gnotobiotikus állatokon végzett korábbi vizsgálatok arra a következtetésre jutottak, hogy az élelmiszer-összetevők (csicseriborsó, szójaliszt, földimogyoró és zöld banán) kombinációját, amely a Dakában végzett vizsgálatok alapján történt, érdemes lesz tisztelettel tanulmányozni. az étrendnek a növekedést diszkriminatív mikrobiota elszaporodását serkentő hatására, valamint a költségekre és a fenntarthatóságra.

A közelmúltban sikeresen befejeztünk egy IRB által jóváhagyott tanulmányt, „Pre-Proof of Concept klinikai vizsgálatok az ólommikrobióta irányított kiegészítő élelmiszerek (MDCF) prototípusainak optimalizálására a mikrobiota éretlenségének helyreállítására és érzékszervi elfogadhatóságuk megállapítására” (PR-16099). Ennek a kísérleti tanulmánynak az volt a fő célja, hogy bemutassa a koncepció előzetes bizonyítását, hogy bizonyos kiegészítő élelmiszerek jótékony hatással lennének a MAM-ban szenvedő kisgyermekekre azáltal, hogy serkentik a bélmikrobióta bizonyos tagjainak szaporodását, amelyek növekedést serkentő hatásaikról ismertek. . Ebben a kísérleti tanulmányban a Microbiota-for-age Z (MAZ) pontszámot, valamint a bélmikrobióta jó tagjainak proliferációjának bizonyos testrendszerekre gyakorolt ​​hatását vizsgáltuk. Ezt a tanulmányt három helyileg előállított MDCF prototípus (MDCF-1, MDCF-2 és MDCF-3) és egy helyben előállított rizslencse alapú RUSF hatásának tesztelésére tervezték. A Pre POC kísérleti kísérlet eredményei meggyőzően kimutatták, hogy a három MDCF közül az egyik (az MDCF-2) bizonyos aminosavak megnövekedett szintjével függött össze, amelyek kulcsszerepet játszanak a hosszú csontok kialakulásában, az agy fejlődésében és a fokozott termelésben. IGF-1 (inzulinszerű növekedési faktor-1), amely kritikus tényező a gyermek növekedésének biológiájában. Hatékonyan serkenti a bélmikrobióta növekedést serkentő tagjainak, például a Faecalibacterium prausnitzii-nek a növekedését is. Ennek a Pre-POC kísérleti kísérletnek az eredménye alapján most egy nagyobb klinikai vizsgálatot tervezünk a legígéretesebb MDCF-2 felhasználásával a Post-SAM MAM gyermekek kezelésére, amelynek elsődleges végpontja a lineáris növekedés.

Kutatási terv és módszerek Klinikai vizsgálatot fogunk végezni 12-18 hónapos, Post-SAM MAM-ban (WLZ <-2 és -3) szenvedő gyermekek körében, körülbelül két éven keresztül. A vizsgálatot a dakkai Mirpur területén található Bauniabadh és RADDA MCH-FP klinikán, valamint a Terre des Hommes (TdH) által vezetett Special Nutrition Unit-ban (SNU) fogják lefolytatni Kurigramban. A TdH SNU-t azért választottuk ki, mert szeretnénk felgyorsítani a beiratkozást, és jó tapasztalataink vannak az ottani munkáról; az utolsó hatékonysági vizsgálatot, amelyet helyi RUTF-einken végeztünk, részben szintén ott végeztük. A gyermekeket a Field Research Assistant (FRA-k) háztartási felmérésen keresztül szűrik és írják be, az előre meghatározott befogadási kritériumok alapján. A beiratkozási feltételek teljesítése és a tanulmányban való részvételhez a szülőktől vagy törvényes gyámoktól származó hozzájárulás megszerzése után a megfelelő anyával/gondozóval rendelkező gyermekeket beíratják, és számítógéppel generált véletlenszámok alapján véletlenszerűen besorolják a két kar valamelyikébe. A hozzárendelt diétatípus kódját egyénenként zárt, átlátszatlan borítékban őrzik, és csak akkor nyitják ki, ha a gondozó aláírja a beleegyező nyilatkozatot. Ez a vizsgálat nem tartozik a tipikus gyógyszervizsgálatok alá. Ha azonban ezt a kísérletet bármely fázisban figyelembe vesszük, akkor az a II. fázis alá esne, mert már végeztünk egy kísérleti kísérletet, amely a mikrobiotára vonatkozó életkori Z-pontszámra gyakorolt ​​hatást, valamint a káros hatásokat vizsgálta.

Mindenekelőtt lesz a stabilizációs szakasz, amely 4-8 napig tart, ezalatt minden gyermeket a WHO (Egészségügyi Világszervezet) / icddr,b SAM kezelési irányelvei szerint kezelnek. Ez magában foglalja a programozott táplálást, a mikrotápanyag-kiegészítést, a megfontolt folyadékpótlást, a széles spektrumú antibiotikum-kezelést, valamint a szövődmények azonnali felismerését és kezelését. A stabilizációs fázisból való felépülés után a táplálkozási rehabilitáció körülbelül 2 hétig folytatódik, amely alatt a helyi Halwa és Khichuri étrenden alapuló icddr,b standard ellátási étrendet szolgálják fel. A SAM-ból MAM-ba való átlépéskor (ödémamentes WLZ <-2) a gyermekeket véletlenszerűen besorolják a két kar egyikébe (rizslencse alapú RUSF és MDCF-2).

A randomizáció utáni táplálkozási rehabilitációs komponens 3 fázisból áll. Az első szakasz a diéta helyszíni táplálását foglalja magában naponta kétszer 1 hónapon keresztül a Mirpurban és Kurigramban létrehozott táplálkozási központokban. A második szakaszban a gyerekeket egyszer a táplálkozási központban, egyszer pedig otthon etetjük. A harmadik szakaszban a gyerekeket naponta kétszer etetik otthon. A gyerekeket 4 hétig megfigyelik a beavatkozás utáni szakaszban. A teljes vizsgálati időszak alatt antropometriai adatokat, élelmiszer-diverzitási adatokat és mintákat (vér, széklet és vizelet) gyűjtenek. Az étrendi beavatkozás során az étkezési gyakorisági kérdőívek segítségével heti minőségi étrendi beviteli adatokat gyűjtünk az elmúlt 24 óráról minden vizsgálati résztvevő esetében.

Randomizálás A stabilizációs és táplálkozási rehabilitációs fázisok után, amikor a gyerekek elérik a MAM állapotot, véletlenszerűen besorolják őket a két kar egyikébe (rizs-lencse alapú RUSF és MDCF-2). A hozzárendelt kezeléstípus kódját zárt, átlátszatlan borítékban tároljuk, amíg a beíratott gyermekhez hozzá nem rendeljük.

1. kar – rizs-lencse alapú RUSF (indoklás: a poszt-SAM, MAM gondozás referenciastandardja; a gyermek növekedésére és a bél mikrobiotára gyakorolt ​​hatásainak ismerete alapján) 2. kar – MDCF-2 prototípus négy ingyenes élelmiszer-összetevővel, por nélkül tej (indoklás: a közelmúltban befejezett, POC előtti klinikai vizsgálat bizonyítékaival, amelyek a növekedést serkentő mikrobióta előmozdítását és a növekedésre gyakorolt ​​pozitív hatásokat mutatják be).

A SAM-ban szenvedő gyermekek toborzását, szűrését és beleegyezését az icddr,b dhakai kórházban, a mirpuri RADDA-MCH-FP klinikán, a kurigrami TdH SNU-ban, valamint a mirpuri közösségekben végzett szűréssel és szűréssel azonosítják. Sadar, Ulipur és Chilmari Upazilas a Kurigram kerületben. A stabilizációs ellátást igénylők a fent említett intézményekbe kerülnek, ahol a SAM akut fázisú kezelésének színvonalát biztosítják. Röviden; ez a stabilizáló ellátás programozott tápláláson, mikrotápanyag-kiegészítésen, megfontolt folyadékpótláson, széles spektrumú antibiotikumos kezelésen, valamint a szövődmények azonnali felismerésén és kezelésén alapul. Ezt követően a táplálkozási rehabilitáció standard diétás protokollja szerint kezelik őket. A MAM végzettség megszerzésekor megkeresik azokat a gyermekek szüleit, akik megfelelnek a SAM utáni MAM-vizsgálat MAM-kritériumainak. Egy képzett terepkutatási asszisztens (FRA) részletesen elmagyarázza a vizsgálatot, válaszol a szülő(k) bármely kérdésére, és felkéri a szülő(k)et, hogy írják be a gyermeket a vizsgálatba.

A vizsgálat elején információkat keresnek a demográfiai jellemzőkről, és az FRA-k digitális mérleggel rögzítik a gyerekek súlyát 2 g-os pontossággal (Seca, 728-as modell, Németország), hosszát (csecsemőmérővel, Seca, 416-os modell, Németország). ), és a felkar középső kerülete mm pontossággal (nem nyúló beillesztő szalag használatával). Az antropometria a szabványos eljárások szerint történik. A vizsgálat résztvevőit arra kérik, hogy jöjjenek a kijelölt táplálkozási központba táplálkozási terápia céljából, hogy biztosítsák az MDCF/RUSF bevitelét. Telefonszámot kapnak, amellyel elérhetik a klinika személyzetét, és a személyzet egy tagja előzetes egyeztetés alapján felkeresheti a család háztartását közvetlenül megfigyelt táplálkozási terápia céljából. Az MDCF-2 vagy RUSF programozott táplálása a táplálkozási rehabilitáció után három hónapig az ábrán látható.

MDCF-2 és RUSF előkészítése:

A fent említett Pre-POC vizsgálatban azonosított kiegészítő élelmiszer-összetevők kompatibilis kombinációi alapján a klinikai vizsgálathoz elegendő mennyiségben készítjük el az MDCF-2-t és a RUSF-et az icddr,b élelmiszer-feldolgozó üzemben Mirpurban és Kurigramban. A két diéta energiasűrűségében és mikrotápanyag-tartalmában megegyezik. Az MDCF-2 energiasűrűsége 125 kcal/25 g (adagonként), a kalóriaeloszlás pedig 45-50 százalékban zsírból és 8-10 százalékban fehérjéből származik. A két adag MDCF-2 vagy RUSF 250 Kcal-t és a szükséges mikrotápanyagokat biztosítja amellett, hogy szubsztrátot biztosít a jótékony mikrobióta proliferációhoz. Az adagok célja, hogy kiegészítsék a szokásos étrendet, amelyet ezek a gyerekek otthon kapnak. Az anyáknak/elsődleges gondozóknak azt tanácsolják, hogy tartsák be gyermekük jelenlegi étkezési és szoptatási gyakorlatát.

Az MDCF-2 prototípusok fejlesztésével és az érzékszervi tulajdonságok értékelésével kapcsolatos kísérleteket a Pre-POC klinikai vizsgálat során végezték.

Az ételeket minden nap elkészítjük, hogy az elkészítés során ne következzen be váratlan szennyeződés és tápanyagveszteség. Bár a nyers élelmiszer-összetevőket nagyon gondosan beszerezzük a helyi piacról és ésszerű mennyiségben tároljuk, az MDCF-2 és a RUSF elkészítésének napján elkészítjük, kiadjuk és etetjük a gyerekeket.

A nyersanyagok (rizs/lencse/csicseriborsó) átvétele után kiszedjük az idegen anyagokat/szemeket vagy magvakat (ha van), azokat ki lehet dobni, majd nyitott serpenyőben megpirítjuk az alapanyagokat. A sütéshez a hőmérsékletet 120-130°C-on tartjuk. Általában 8-10 percet vesz igénybe 100 g nyersanyag megsütése. A folyamatos keverés elengedhetetlen az egyes magvak/szemek pörkölésének biztosításához. A sütés befejezése után félretesszük hűtésre, majd ledaráljuk. Fogjuk a port és szűrővel leszűrjük. 4-5-szöri szűrés után a finom port a többi hozzávalóval (tejpor/olaj) való összekeveréshez vesszük. A cukrot is ledaráljuk, a finom port pedig a keveréshez használjuk. Végül hozzáadjuk az előre kimért premixport. Az egész zöld banán feldolgozása eltér a többi összetevőtől. A héjas zöld banánt egy mély serpenyőbe helyezzük forrásban lévő vízbe (100-110 °C), és körülbelül 17-20 percig főzzük, amíg megpuhul és megpuhul. A zöld banán héját lehúzzuk, az ehető fehér részt pedig kis darabokra reszeljük. Ezután egy edénybe tesszük és hagyjuk kihűlni. A kis banándarabokat kanállal/kézi aprítóval összetörjük. Az összes többi összetevő tömegét rögzítjük. A lehetséges recepteket kis tételekben állítják elő úgy, hogy az összes hozzávalót összekeverik egy elektromos turmixgépben. Az élelmiszerek különböző lépésekben történő elkészítését, azaz a pörkölést, a szemcseméret-csökkentést, a homogén turmixolást és a táplálkozási központokba való bejuttatást az icddr,b kutatók ellenőrzik. Az ételeket minden nap elkészítjük, hogy az elkészítés során ne következzen be váratlan szennyeződés és tápanyagveszteség. Bár a nyers élelmiszer-összetevőket nagyon gondosan beszerezzük a helyi piacról és ésszerű mennyiségben tároljuk, az MDCF és a RUSF elkészítésének napján elkészítjük, kiadjuk és etetjük a gyerekeket.

Etetési alkalmak:

Kérjük a gyermekeket és az anyákat/gondozókat, hogy az első hónapban minden nap 9-11 és 17-17 óra között jöjjenek el a telephelyeken kialakított táplálkozási központokba. Kérjük az anyákat, hogy a megfigyelt étkezést megelőző 2 órában ne adjanak ételt és anyatejet. A gyermeknek adagonként 25 gramm MDCF-2-t vagy RUSF-et kínálnak a véletlen besorolás alapján. Az anyákat arra kérik, hogy az alábbiakban leírtak szerint kanalazzanak meg gyermekeiknek az előre kimért diétát, amíg az nem hajlandó enni. Kétperces szünet után ugyanazt a diétát másodszor is felkínálják mindaddig, amíg újra vissza nem utasítja. A második kétperces szünet után a diétát harmadszor ajánlják fel, amíg újra meg nem tagadják. A harmadik visszautasítás után az etetési epizód „megszakítottnak” minősül. Az etetés időtartamát (kivéve a közbenső „pihenőidőket”) a stopper rögzíti, és az etetés teljes időtartamát. Ez az etetési epizód legfeljebb 60 percig tart. A sima víz mért térfogatait is megadják, és megmérik a 60 perces étkezési időszak alatt elfogyasztott víz mennyiségét. Az etetési epizód képzett tanulmányozó személyzet közvetlen felügyelete alatt zajlik majd. A gyermekeket úgy tekintik, mint akik megtagadják a további bevitelt, ha elmozdítják a fejüket az ételtől, sírnak, összeszorítják a szájukat vagy összeszorítják a fogukat, vagy izgulnak, kiköpik az ételt vagy nem hajlandók lenyelni. A ténylegesen bevitt MDCF-2/RUSF mennyiségét úgy számítják ki, hogy a felajánlott mennyiségből levonják a maradékot, vagy megkérdezik az anyát, amikor otthon táplálják. A beiratkozott gyermekeket a helyszíni kutatási asszisztensek naponta ellenőrzik az esetleges mellékhatások/nemkívánatos események (pl. kiütés, csalánkiütés ételallergia vagy a klinikai állapot bármely jelentős változása miatt) egy hétig. Ha bármilyen mellékhatást/nemkívánatos eseményt észlelnek, azokat a standard ellátásnak megfelelően kezelik. A RUSF és az MDCF-2 minőségének ellenőrzésére szabványosított gyártási eljárást kell követni. Az első 4 hétben minden gyermeknek naponta kétszer 25 gramm diétát kínálnak az etetőközpontban. A következő hónapban a gyermeknek 25 g táplálékot kínálnak az etetőközpontban, és további 25 g-ot egy tiszta edényben, hogy otthon etethessen. A harmadik hónapban minden nap két külön 25 grammos diétát tartalmazó edényt biztosítunk minden beíratott gyermeknek a résztvevő otthonában. A takarmányozási információkat az anyáktól gyűjtik, és az elfogyasztott mennyiséget a bal oldali kijáratokból mérik. Az ételt steril edényekben és szobahőmérsékleten kell tárolni az etetés között. Az élelmiszerek minőségét úgy biztosítják, hogy az elkészített élelmiszerek mintáit 2 havonta mikroba és penészgombákra vizsgálják az icddr,b. A vizsgálatra kiválasztott minták a főzés után 2 és 6 órán keresztül tárolt élelmiszereket tartalmazzák. A mintákat félévente az SGS Laboratories, Delhiben is megvizsgálják aflatoxin szempontjából.

Ebben a tanulmányban a táplálkozási állapotot antropometriával értékelik, összehasonlítva a WHO növekedési referenciastandardjaival. A vizsgálat kezdetén információkat keresnek a demográfiai jellemzőkről (családok vagyoni helyzete, lakhatási színvonal, családszerkezet és szülői jellemzők stb.), és az FRA-k digitális mérleggel, 2g-os pontossággal rögzítik a gyerekek súlyát (Seca, 728-as modell, Németország), hossz (csecsemőmérővel, Seca, 416-os modell, Németország) és a felkar középső kerülete mm pontossággal (nem nyúló behelyezőszalaggal). Az antropometriát a szabványos eljárások szerint végezzük, és minden mérést háromszor végeznek el, és az átlagértéket rögzítik.

Székletminta gyűjtés A stabilizáció akut fázisában a székletminta gyűjtése minden alternatív napon történik. A rehabilitációs szakaszban heti ürülékmintákat (1-2g) gyűjtenek a gyártást követő 30 percen belül (otthon és visszaszállítják az icddr,b-be) a közelmúltban használt nitrogén száraz szállítói mintagyűjtő SOP (Standard Operating Procedure) segítségével. Pre-POC klinikai vizsgálat (A függelék). A mintákat -80°C-on tárolják, mielőtt minden vizsgálat végén a Gordon Labba küldenék őket a mikrobiota érettségének elemzésére (az MDCF-2-vel és RUSF-vel végzett kezelés előtt, alatt és után mérve), valamint a PCR-alapú értékelés céljából. enteropatogén terhelés a székletmintákban (MDCF-2 kezelés előtt és után mérve). Összesen 12 székletmintát vesznek minden gyermektől különböző időpontokban a teljes vizsgálati időszak alatt. Feltételezve, hogy a vizsgálatban 62 résztvevő vesz részt karonként, összesen 1488 székletmintát gyűjtünk ebben a vizsgálatban. Ezzel együtt 2 g székletmintát veszünk az anyáktól a stabilizációs fázis kezdetén.

Vizeletminta gyűjtése Összesen 7 vizeletmintát (egyenként 2 ml-t) veszünk minden gyermektől különböző időpontokban a teljes vizsgálati időszak alatt. Feltételezve, hogy a vizsgálatban 62 résztvevő vesz részt karonként, ebben a vizsgálatban összesen 868 vizeletmintát gyűjtenek. Ezzel együtt 5 ml vizeletmintát veszünk az anyáktól a stabilizációs fázis elején.

Vérminta vétel Összesen 4 vérmintát (egyenként 2 ml-t) veszünk különböző időpontokban a teljes vizsgálati időszak alatt. Mindegyiket minden gyermektől begyűjtik a stabilizációs szakasz elején, a beavatkozás előtt; a beavatkozás első hónapjának végén és közvetlenül a beavatkozás befejezése után.

Feltételezve, hogy a vizsgálatban 62 résztvevő vesz részt karonként, összesen 496 plazmamintát gyűjtenek ebben a vizsgálatban. Ezzel együtt 5 ml vérmintát veszünk az anyáktól a stabilizációs fázis kezdetén.

Az anya tápláltsági állapota összefügg a gyermek tápláltsági állapotával, amint azt nyolc országban végzett MAL-ED vizsgálatunk eredményei mutatják. Ezenkívül a születés előtti és az anyai tényezők korai meghatározói voltak az életkorhoz képest alacsonyabb hosszúságnak, és hozzájárulásuk az élet első 24 hónapjában is fontos maradt. Ennek megfelelően rögzítjük az anya magasságát és súlyát. Az anya táplálkozási biológiai állapotának megértése érdekében széklet-, vér- és vizeletmintát kérnek az anyától. Ezeket a mintákat elemezni fogják a bélmikrobióta és a proteomika szempontjából, és az eredmények korrelálnak a beiratkozott gyermekek eredményeivel.

Antropometria A gyermek életkorát a gyermek születési dátumáról szóló dokumentumok (születési anyakönyvi kivonat vagy oltási kártya, ha van) vagy gondozói jelentés alapján igazolják. A hosszt 0,1 cm-re érzékeny csecsemőmérővel mérjük. A testtömeg mérése 2g-ra érzékeny mérleggel történik (SECA 7281321009, Hamburg, Németország). A hosszúság-életkor (LAZ), a súly-hosszúság (WLZ) és a súly az életkor szerint (WAZ) Z-pontszámokat a Multicentre Growth Reference Study (MGRS) WHO növekedési standardjai alapján számítják ki. Az ödéma vizsgálata mindkét láb felső részének 3 másodpercig tartó megnyomásával történik. A középső felkar kerületét (MUAC) TALC MUAC szalaggal (UK) kell mérni. A mérőberendezések rendszeres szabványosítását szabványok segítségével, minden nap, képzett terepkutató asszisztens végzi.

Plazma- és székletminták elemzése Az ebből a kísérletből gyűjtött plazmamintákat Dr. Jeffrey Gordon laboratóriumába küldik a St. Louis-i Washington Egyetem Genomtudományi és Rendszerbiológiai Központjában. Fejlett tömegspektroszkópiai és immunológiai vizsgálaton alapuló módszereket fognak alkalmazni, hogy új ismereteket szerezzenek a bél mikrobiota éretlenségének szerepéről, valamint az éretlenség ólom-mikrobióta-irányított kiegészítő táplálékkal (MDCF-2) történő akut helyreállítási kísérletének hatásairól a biomarkerekre és közvetítőkre. egészséges növekedés. Összehasonlításokat végeznek a kontrollcsoporttal (azaz a referencia RUSF szabványt fogyasztókkal). Célzott ultrateljesítményű folyadékkromatográfiás tömegspektrometriát (UPLC-MS) és gázkromatográfiás-tömegspektrometriát (GC-MS) használnak a plazma- és/vagy székletmintákban a specifikusan érdekelt analiták, köztük az epesavak és a rövid szénláncú zsírsavak (SCFA-k) profilálására. ); a mitokondriális funkció markerei (például β-hidroxi-butirát, acilkarnitinek/acilCoA-k, TCA ciklus közbenső termékek); aminosavak a szérumban és a székletmintákban [elágazó láncú aminosavak, triptofán és triptofán metabolitok, amelyek a növekedéshez és a gyulladásos állapothoz kapcsolódnak, beleértve azokat is, amelyeket a bakteriális triptofán metabolizmus (pl. indol-ecetsav-származékok)]. Ezen kívül a lineáris növekedés (pl. növekedési hormon és IGF-1), az energiafelhasználás (inzulin, leptin) és a csontbiológia kulcsfontosságú mediátorai/biomarkerei [IL-6 (interleukin-6), oszteoprotegerin, a C-terminális peptid típusú kollagén (CTX, az oszteoklasztaktivitás/csontreszorpció markere) és az 1-es típusú prokollagén amino-terminális propeptidje (P1NP, az oszteoblaszt aktivitás/csontképződés markere)], valamint a szisztémás gyulladás (CRP, AGP) számszerűsítve bevált ELISA/Luminex tesztekkel. A vérben lévő fehérjéket a SOMAlogic szkenneléssel azonosítják, amely több mint 1300 különböző fehérje azonosítását teszi lehetővé. A SAM-ban szenvedő gyermekek plazmamintáin végzett proteomikai vizsgálat az előző, Dakában végzett Pre-POC vizsgálatunkban már számos jelentős és klinikailag releváns összefüggést igazolt bizonyos fehérjék és klinikai fenotípusok között a SOMAlogic vizsgálat segítségével.

Az összegyűjtött információkat emberi székletminták kiválasztására fogják felhasználni csíramentes állatokba való átültetéshez; ezeket az állatokat, amelyeket humán mikrobióta donoraik étrendjével etetnek, az MDCF-2 prototípusait, a bélmikrobiótát és a gazdaszervezet fiziológiáját/metabolizmusát összekapcsoló mechanizmusok további jellemzésére fogják használni. Ezenkívül ezeket a plazma és széklet biomarkereket fogják használni annak meghatározására, hogy az MDCF-2 elősegíti a mikrobiota éretlenségének helyreállítását és javítja a gyermekek biológiai állapotát.

A minta méretének kiszámítása A különböző MDCF-ek POC előtti vizsgálatában az MDCF2-t (Microbiota Directed Complementary Food 2) kapó gyermekek kiindulási súly-hosszúsági Z pontszáma -2,2 volt, egy hónapos kiegészítés után pedig -1,7. Ha a WLZ -2-t az alapvonalon és a -1,7-et a végvonalon, az összesített SD-t (szórás) 0,53-nak vesszük, akkor a minta mérete 49 mindkét karon 80%-os teljesítmény és 5%-os szignifikanciaszint mellett. 20%-os lemorzsolódás mellett 62 gyermeket kell beíratni mindkét karba. Ezért ebben a kísérletben 62 gyermek MDCF-2-t és 62 gyermek rizslencse RUSF-et kap.

Adatelemzés:

A Post SAM-MAM-ben szenvedő gyermekek két csoportját összehasonlítják az alapvonalon és különböző időpontokban, amint az a próbatervezésről szóló ábrán látható. Az összehasonlítás klinikai kimenetelének változói közé tartozik a súlygyarapodás mértéke, az antropometriai mutatók és a morbiditás. A „Plazma- és székletminták elemzése” részben említett összes analit összehasonlításra kerül az MDCF-2 és a RUSF csoportok között.

Az emberi jogok védelmének etikai biztosítéka A tanulmány az icddr,b Kutatási Felülvizsgálati Bizottság és az Etikai Felülvizsgálati Bizottság IRB (Institutional Review Board) jóváhagyását követően indult. A vizsgálatba való beiratkozás előtt a vizsgálatban résztvevők törvényes gyámjától írásos beleegyezést kell kérni. A beiratkozáskor és egyéb tanulmányi eljárások során felvett személyazonosító okmányokat lakat alatt őrzik.

Ebben a protokollban a várható kockázatok/mellékhatások a vérminta vételével, a székletminta vételével és a mikrobióta által irányított kiegészítő táplálékkal kapcsolatosak. Ezek egyike sem minősül súlyos nemkívánatos eseménynek (SAE). A vérvételhez kapcsolódó várható nemkívánatos események (EAE) a következők:

• kényelmetlenség
• fájdalom
• fertőzés bevezetése
• vérzés

• ájulás vagy véraláfutás

  • Óvintézkedéseket kell tenni a fertőzés bejutásának elkerülése érdekében a vénapunkció helyének fertőtlenítésével és steril felszereléssel
  • A vérzés és a zúzódások kockázata minimálisra csökken, ha a vénapunkciót követően azonnali nyomást alkalmaznak
  • A résztvevő (gyermek) a vérvétel során ülő vagy fekvő helyzetben kell lennie, hogy elkerülje az ájulásból eredő sérüléseket

Minden lehetséges nemkívánatos eseményt megfelelően kezelnek. Ezek a következők lesznek:

• Hányás
• Hasmenés
• Bőrkiütés
• Ételallergia okozta csalánkiütés
• Hasi feszülés
• Hasi fájdalom A nemkívánatos események értékelése Mind a súlyos, mind a nem súlyos nemkívánatos események súlyosságát értékelni kell; kapcsolat a tanulmányi részvétellel; megtett intézkedések; és az eredményeket. Minden SAE-t jelenteni kell az icddr,b ERC-jének (Ethical Review Committee) 24 órán belül azután, hogy a helyszín tudomást szerzett az eseményről, amelyet viszont továbbítanak a szponzornak. Ez közvetlen telefonon, faxon vagy e-mailben történik.

Az icddr,b IRB által javasolt irányelveket kell követni a nemkívánatos események osztályozása során, ha előfordulnak ilyenek.

Súlyosság:

1. Enyhe
2. Mérsékelt
3. Szigorú

Kapcsolat a tanulmányi részvétellel:

1. Határozottan kapcsolódó: Egyértelmű időbeli asszociáció, nincs más lehetséges ok
2. Lehetséges összefüggés: Kevésbé egyértelmű időbeli asszociáció, egyéb okok lehetségesek
3. Nincs összefüggés: A tanulmánytól függetlenül bizonyíték van arra, hogy az esemény határozottan összefügg egy másik etiológiával

Műveletek:

Nincs Gyógyító terápia (egynél több gyógyszeradag szükséges) A ​​vizsgálatban való részvételtől véglegesen megszűnt Kórházi kezelés Egyéb

Eredmények:

Folyamatos ismeretlen együttműködési megállapodások megoldása Ez a projekt a Washingtoni Egyetem Orvostudományi Karának kutatói és a Banglades-i Hasmenés Betegségek Kutatóközpontja (icddr,b) közös erőfeszítése. A klinikai munkákat és a tereptevékenységeket a bangladesi Dhakában és Kurigramban végzik, a vezető kutató közvetlen felügyelete alatt, míg a laboratóriumi elemzéseket a St. Louis-i Washington Egyetem Gordon Labjában végzik majd. Valamennyi kutatóegység és az együttműködő kutatók hosszú nemzetközi együttműködési múlttal rendelkeznek. Minden vizsgáló kommunikált a projekt fejlesztése során, és elkötelezett a sikeres megvalósítás mellett.

Rendelkezésre álló létesítmények Az icddr,b jól felszerelt élelmiszer-feldolgozó laborral rendelkezik, amely megkönnyíti a diétás receptekkel kapcsolatos kísérleteket. Jelenleg folyamatban vannak a tanulmányaink Mirpur Baoniabad területén. Számos projektiroda található ott. Ennél is fontosabb, hogy kiváló kapcsolatot ápolunk a közösséggel. A Terre des Hommes, amely az SNU-t működteti Kurigramban, ahol a tárgyalás egy részét lefolytatják. A múltban segítettünk az SNU fejlesztésében, és végeztünk ott tanulmányokat. Az SNU-nak nagy hírneve van a közösségben.

Genome Sciences Center, Washington Egyetem St. Louisban:

A székletminták alikvotjai az icddr,b helyen lesznek. A székletmintákat Jeffery Gordon professzor St Louis-i Laboratóriumába küldik a nagy áteresztőképességű 16S riboszomális RNS génszekvenálás céljából. Az MDCF-2 kezelés előtt és után a székletmintákban az enteropatogének széles körének jelenlétét/bőségét PCR (polimeráz láncreakció) alapú vizsgálattal határozzuk meg. A székletminták felhasználhatók az alkotó baktériumtörzsek tenyésztésére is a Gordon Labban végzett gnotobiotikus egereken végzett jövőbeni vizsgálatokhoz. Itt érdemes megemlíteni, hogy az ezek elvégzéséhez szükséges vizsgálatok és berendezések jelenleg csak néhány laboratóriumban állnak rendelkezésre a világon, köztük a St Louis-i laboratóriumban. A Központ ad otthont egy interdiszciplináris, több osztályból álló, többgenerációs kutatócsoportnak több iskolából, amelyek az összehasonlító genomikára, a statisztikai genomikára és a rendszerbiológiára összpontosítanak. A központ „bizonyítótereként” szolgál új stratégiák kidolgozásához a hallgatók és oktatók oktatására. a biológiai, fizikai, számítástechnikai és műszaki tudományok határfelületén kíván dolgozni.