Caffeina, DNA e Cognizione

Per studiare gli effetti interindividuali della caffeina sulle prestazioni cognitive verrà utilizzato un progetto crossover in doppio cieco, controllato con placebo che incorpora periodi alternati di esposizione alla caffeina "a lungo termine" e astinenza. La procedura che i partecipanti devono seguire in ciascuna delle quattro settimane dello studio è descritta in dettaglio di seguito.

1. Visita di base: questionario di base, antropometria, familiarizzazione con le procedure e i compiti dello studio. Ai partecipanti verrà fornita l'integrazione della settimana 1 (n= 18 capsule) e fiale di saliva (n= 6) per la raccolta del campione di saliva. Ai partecipanti verranno inoltre forniti caffè decaffeinato, tè e cacao, a seconda delle loro preferenze.
2. Giorni 1-6: placebo o capsule di caffeina x 3 al giorno alle 09:00, 11:00 e 15:00. La conformità con l'integrazione di caffeina e placebo sarà valutata da un campione di saliva ogni giorno alle 17:00 per ciascuno dei giorni di integrazione a lungo termine. Le concentrazioni di caffeina nel sangue e nella saliva sono fortemente correlate e i livelli in genere aumentano progressivamente durante il giorno (a causa del consumo intermittente di bevande contenenti caffeina). Il miglior saggio biologico a campione singolo dell'assunzione giornaliera di caffeina è fornito da campioni ottenuti nel tardo pomeriggio (James, 1994; James & Rogers, 2005).
3. Giorni 5 e 6: In preparazione per i giorni di "sfida" e per controllare i fattori ambientali che hanno dimostrato di influenzare l'inducibilità dell'enzima CYP1A2, ai partecipanti verrà chiesto di astenersi dall'alcol per 48 ore ed evitare un intenso esercizio fisico per 24 ore prima del prove ed evitare il consumo di cibi crociferi (broccoli e cavoletti di Bruxelles) (Gunes & Dahl, 2008). Infine, ai partecipanti verranno forniti diari dietetici per registrare tutti i cibi e le bevande consumati durante le 24 ore prima di tutte e quattro le prove sperimentali.
4. Giorno 7 (giornata sperimentale): ai partecipanti verrà chiesto di presentarsi al laboratorio dopo un digiuno notturno e seguiranno la procedura mostrata di seguito:

09:00: Campione di saliva pre-integrazione e compiti cognitivi

09:30: Integrazione con 3 mg/kg di massa corporea di caffeina o placebo

10:30: Primo campione di saliva post-integrazione e compiti cognitivi

12:30: Secondo campione di saliva post-integrazione e compiti cognitivi

13:00: un pasto contenente succo di frutta o bibita e un panino al formaggio

15:30: Terzo campione di saliva post-integrazione e compiti cognitivi

I campioni di saliva verranno prelevati all'arrivo e 1, 3 e 6 ore dopo l'integrazione. Il primo campione verrà prelevato per verificare l'aderenza al requisito di non assumere l'integrazione mattutina, quindi essere in astinenza da caffeina, indipendentemente dal braccio dello studio. È stato dimostrato che 1 mg/kg di caffeina porta a livelli plasmatici di caffeina di circa 1 μg/ml e ci si può aspettare che la concentrazione di caffeina nella saliva sia circa il 70% dei livelli plasmatici (Walther et al., 1983). Livelli medi di caffeina nella saliva inferiori a 1 μg/ml sono stati precedentemente riportati per l'astinenza da caffeina durante la notte (Evans & Griffiths, 1999). Dopo il trattamento con caffeina, i livelli salivari di caffeina aiuteranno nella determinazione del metabolismo della caffeina (Dodd et al., 2015).

L'integrazione verrà deglutita con acqua in proporzione al peso del partecipante (3 ml/kg di massa corporea). Durante le giornate sperimentali, ai partecipanti verrà chiesto di consumare acqua ad libitum nella prima prova e un volume uguale nelle prove successive. Verrà inoltre chiesto loro di evitare l'esercizio tra le prove.

I compiti cognitivi saranno eseguiti in quattro punti temporali: pre- e 1, 3 e 6 ore dopo l'integrazione. Quando si utilizza la caffeina anidra in capsule, il picco di concentrazione di caffeina si verifica solitamente circa 1 ora dopo l'ingestione (Graham, 2001). Pertanto, la misurazione dei metaboliti della caffeina per 1 ora dopo l'ingestione di caffeina misurerebbe principalmente l'assorbimento della caffeina e non il metabolismo, che è determinato dall'enzima CYP1A2. Pertanto, gli studi che studiano gli effetti dei genotipi CYP1A2 sugli effetti della caffeina dovrebbero concentrarsi sull'utilizzo di protocolli che durano > 1 ora, poiché questi effetti possono essere più evidenti in eventi che durano più di 1 ora, dove il metabolismo della caffeina può avere un effetto più pronunciato. Va inoltre notato che l'emivita della caffeina è in media di 4-6 ore (Nehlig, 2018) nella maggior parte degli adulti e non è ancora noto fino a che punto il metabolismo della caffeina sia alterato tra metabolizzatori veloci e lenti. Pertanto, non è noto in quale momento ci sarebbe una differenza abbastanza grande nei livelli circolanti di caffeina tra metabolizzatori veloci e lenti da avere un impatto significativo sull'ergogenicità della caffeina (Southward et al., 2018). Per questo motivo, abbiamo selezionato 3 diversi punti temporali post-integrazione per completare i compiti cognitivi: 1 ora post-integrazione è stata selezionata per consentire il confronto con diversi studi precedenti sulla caffeina, perché è il punto temporale più frequentemente utilizzato per testare le prestazioni cognitive post-integrazione. integrazione in letteratura (Carswell et al., 2020). Abbiamo anche aggiunto i punti temporali post-integrazione di 3 ore e 6 ore poiché rientrano nell'intervallo medio dell'emivita della caffeina e per studiare le differenze nelle prestazioni tra metabolizzatori "rapidi" e "lenti". Ipotizziamo che coloro che metabolizzano la caffeina più velocemente non manterrebbero alti livelli di caffeina nella saliva durante l'evento di 6 ore rispetto a quelli con un metabolismo della caffeina più lento.

Al termine di ogni giornata sperimentale, ai partecipanti verranno fornite le capsule per la settimana successiva, nonché le fiale per il prelievo di caffeina nella saliva.

Una volta forniti, i campioni saranno mantenuti congelati a -20 °C fino all'analisi. I livelli salivari di caffeina saranno misurati utilizzando la tecnica del saggio immunoenzimatico moltiplicato (EMIT) mediante metodo spettrofotometrico. Il saggio EMIT è un immunodosaggio enzimatico omogeneo destinato all'uso nella determinazione della caffeina come metabolita e sarà preferito dato che è meno invasivo rispetto all'utilizzo della caffeina sierica e si è dimostrato affidabile e riproducibile (Tripathi et al., 2015). Livelli sierici di caffeina superiori a 30 μg/ml richiedono diluizione se analizzati mediante dosaggio EMIT.