咖啡因、DNA 和认知

双盲、安慰剂对照的交叉设计结合了“长期”咖啡因接触和戒断的交替期，将用于研究咖啡因对认知表现的个体间影响。 下文详细描述了参与者在研究的四个星期中的每一周都需要遵循的程序。

1. 基线访问：基线调查问卷、人体测量学、熟悉研究程序和任务。 将向参与者提供第 1 周的补充剂（n=18 粒胶囊）和用于收集唾液样本的唾液瓶（n=6）。 还将根据参与者的喜好为参与者提供不含咖啡因的咖啡、茶和可可。
2. 第 1-6 天：安慰剂或咖啡因胶囊 x 3，每天 09:00、11:00 和 15:00。 对于长期补充的每一天，每天 17:00 通过唾液样本评估对咖啡因和安慰剂补充的依从性。 血液和唾液中的咖啡因浓度高度相关，并且水平通常在白天逐渐增加（由于间歇性饮用咖啡因饮料）。 每日咖啡因摄入量的最佳单样本生物测定由下午晚些时候获得的样本提供（James，1994；James & Rogers，2005）。
3. 第 5 天和第 6 天：为准备“挑战”日并控制已显示影响 CYP1A2 酶诱导能力的环境因素，将要求参与者戒酒 48 小时，并在开始前 24 小时避免剧烈运动试验并避免食用十字花科食物（西兰花和抱子甘蓝）（Gunes & Dahl，2008 年）。 最后，将向参与者提供饮食日记，以记录所有四项实验试验前 24 小时内消耗的所有食物和饮料。
4. 第 7 天（实验日）：参与者将被要求在禁食过夜后前往实验室，他们将遵循以下程序：

09:00：补充前唾液样本和认知任务

09:30：补充 3 mg / kg 体重的咖啡因或安慰剂

10:30：第一次补充后唾液样本和认知任务

12:30：第二次补充后唾液样本和认知任务

13:00：含果汁或软饮料和奶酪三明治的一餐

15:30：第三次补充后唾液样本和认知任务

将在到达时以及补充后 1、3 和 6 小时采集唾液样本。 第一个样本将被用来验证是否遵守了不服用早晨补充剂的要求，因此无论研究组如何，都应戒除咖啡因。 已经表明，1 mg/kg 的咖啡因导致咖啡因血浆水平约为 1 μg/ml，唾液中的咖啡因浓度预计约为血浆水平的 70%（Walther 等人，1983 年）。 先前已报道过夜咖啡因戒断的平均唾液咖啡因水平低于 1 微克/毫升 (Evans & Griffiths, 1999)。 在含咖啡因的治疗后，唾液中的咖啡因水平将有助于确定咖啡因的代谢（Dodd 等人，2015 年）。

将用与参与者体重成比例的水（3 毫升/千克体重）吞服补充剂。 在实验期间，将要求参与者在第一次试验中随意饮水，并在随后的试验中饮水量相等。 他们还将被要求避免在试验之间锻炼。

认知任务将在四个时间点执行：补充前和补充后 1、3 和 6 小时。 在胶囊中使用无水咖啡因时，咖啡因浓度峰值通常出现在摄入后约 1 小时 (Graham, 2001)。 因此，测量咖啡因摄入后 1 小时的咖啡因代谢物主要是测量咖啡因的吸收，而不是代谢，后者由 CYP1A2 酶决定。 因此，调查 CYP1A2 基因型对咖啡因影响的研究应侧重于使用持续 > 1 小时的方案，因为这些影响在持续时间超过 1 小时的事件中可能更为明显，其中咖啡因的代谢可能具有更明显的影响。 还应注意的是，咖啡因的半衰期在大多数成年人中平均为 4-6 小时（Nehlig，2018 年），目前尚不清楚快代谢者和慢代谢者之间咖啡因代谢的变化程度。 因此，尚不清楚快代谢者和慢代谢者之间的咖啡因循环水平在什么时间点会有足够大的差异，从而对咖啡因的增效性产生重大影响（Southward 等人，2018 年）。 出于这个原因，我们选择了补充后 3 个不同的时间点来完成认知任务：选择补充后 1 小时以允许与之前的几项咖啡因研究进行比较，因为它是测试认知能力后最常用的时间点。补充文献（Carswell 等人，2020 年）。 我们还添加了补充后 3 小时和 6 小时的时间点，因为它们在咖啡因半衰期的平均范围内，并研究“快”和“慢”代谢者之间的性能差异。 我们假设与那些咖啡因代谢较慢的人相比，那些代谢咖啡因更快的人不会在整个 6 小时事件中保持高唾液咖啡因水平。

在每个实验日结束时，将向参与者提供下一周的胶囊，以及用于唾液咖啡因采样的小瓶。

一旦提供，样品将在-20 °C 下冷冻保存，直到进行分析。 唾液中的咖啡因水平将使用酶倍增免疫测定技术 (EMIT) 通过分光光度法进行测量。 EMIT 测定是一种均质酶免疫测定，旨在用于将咖啡因确定为代谢物，并且由于它比使用血清咖啡因侵入性更小并且已被证明可靠且可重复，因此将是首选（Tripathi 等人，2015）。 当通过 EMIT 测定法分析时，血清咖啡因水平大于 30 μg/ml 需要稀释。