血漿グルタミン酸に対する硫黄アミノ酸枯渇とアセトアミノフェンの影響

この研究の目的は、高分解能 1H-NMR を使用して、複雑な化学混合物および食事と化学的相互作用による代謝の毒性学的摂動を評価することです。 これらの実験は、健康な人の代謝プロファイルの正常な変動の程度に関するデータを提供するように設計されており、主要なGSH酸化還元測定と組み合わせて、化学物質への曝露と食事による変化を区別できるかどうかを示します。

現在のプロトコルの具体的な目的は次のとおりです。

1. SAAフリー食(2日間)およびAPAP(15mg/kgで2回投与)がSAA恒常性および代謝、およびチオールジスルフィド酸化還元状態(GSH/GSSGおよびCys/CySS)を独立して変化させるかどうかを決定する。
2. 2回分のAPAPが血漿GSH濃度および酸化還元状態に及ぼす影響においてSAAフリー食(2日間)と相互作用するかどうかを判定する。
3. 1H-NMR分光法を使用して、APAPとSAAを含まない食事への複合曝露によって誘発される代謝変化が、いずれか単独で誘発される代謝変化と量的または質的に異なるかどうかを判断します。

A. 背景と意義:

硫黄アミノ酸は中心的な代謝プロセスに関与しています。 硫黄含有アミノ酸のメチオニンとシステインは、タンパク質合成、メチル化、脂肪酸代謝、浸透圧調節、細胞分裂と成長の調節など、多様で重要な生物学的機能に必要です (1-5)。 メチオニン (Met) は必須アミノ酸であり、体内では硫黄転移経路によって代謝されてシステイン (Cys) を形成します (6)。 Met と Cys は、ほとんどのタンパク質の一次配列での使用に加えて、他の代謝機能にも必要です。 Met は S-アデノシルメチオニンに変換され、タンパク質、RNA、DNA の構造的および機能的修飾、およびリン脂質やシグナル伝達分子の合成のためのメチル化反応 (1) に使用されます。 システインは、グルタチオン (GSH) と硫酸塩の生合成に使用されます (2)。 GSH は酸化還元調節 (7) および酸化剤と反応性求電子試薬の解毒 (8) で機能します。硫酸塩は、オリゴ糖の構造成分 (3)、ステロイド ホルモンの輸送 (4)、外来化合物の解毒 (9) として使用されます。 SAA は前述のプロセスで不可逆的に修飾されるため、正常なタンパク質合成と代謝回転を維持するための十分な量を超えた、適切な硫黄アミノ酸摂取が必要となります。

ヒトにおける硫黄アミノ酸摂取量は変動しており、最適な SAA 摂取量は適切に定義されていません。 SAA に対する推奨食事許容量は窒素と硫黄のアミノ酸バランス研究に基づいており、成人男性の場合は約 1 g (Met 210 mg と Met または Cys 800 mg を加えたもの) です (10,11)。 平均的なアメリカ人の食事には、1 日あたり約 100 g のタンパク質が含まれています (2)。 SAA の平均摂取量は約 2.4 g ですが、0.3 g 未満から 5 g を超えるまでの範囲で大きなばらつきがあります (12)。 SAA の大部分は動物性タンパク質に由来しており、タンパク質摂取量の約 2/3 を占めます。 マメ科植物や一部のナッツを除いて、植物由来のタンパク質 1 グラムには、動物性タンパク質の SAA 含有量の 10 ～ 20% しか含まれていません (13,14)。 植物由来の食品は総タンパク質が少ないため、動物性タンパク質を摂取しない人は SAA 欠乏症のリスクがあります。 食事からのSAA摂取量が少ないアメリカ人の数は比較的少ないですが、ほとんどの人は食品の選択、ダイエット、絶食、病気などが原因で断続的にSAA欠乏症になります。 ヒトの肝臓におけるタンパク質以外の Cys 含有量は約 1 g で、主に GSH に含まれており、1 日の SAA 必要量に近似しています (15)。

化学的解毒はSAAの供給に負担をかけます。 GSH 結合と硫酸結合は、外来化合物の代謝に共通かつ定量的に重要な経路を表します。 本研究での使用が提案されている一例は、アセトアミノフェン (APAP) です。 APAP の約 15% は親化合物として排泄され、約 55% はグルクロン酸との結合によって代謝されます (16-18)。 残りは硫酸塩 (25%) および GSH (5%) との結合によって代謝されます。 最大強度のアセトアミノフェン（分子量 151）を 4 回、つまり毎日 4 g 摂取した場合の代謝を考慮すると、GSH 結合中に 200 mg の Cys が消費され、結合のための硫酸塩を供給するために 1 g の Cys が消費されます (15)。 食事に硫酸塩または亜硫酸塩が添加されていない場合、硫酸塩の大部分は食事性 SAA に由来します (2,19)。 したがって、APAP の 1 日最大用量の代謝に必要な SAA の総当量は、SAA の RDA よりも大きくなります。 したがって、APAP摂取とSAA欠乏症との間の相互作用が予想され、この相互作用は、通常の治療用量および比較的中程度のレベル（例えば、1または2日）のSAA欠乏症であっても重大である可能性がある。 我々は、これがヒトにおける化学相互作用を調査するための有用なモデルを提供し、APAPとCysの主要な代謝産物が容易に測定可能であるため、SAA代謝に対するAPAPとAPAP代謝に対するSAAの利用可能性という逆の効果を決定できることを提案します。 Cys欠損とAPAP代謝は両方ともGSH恒常性に影響を及ぼし、GSH酸化還元に関する我々の臨床アッセイ(7, 20-21)は、これら2つの実験操作の相互作用効果を評価する高感度な手段を提供する。

高分解能 1H-NMR および質量分析は、食事の複雑な代謝効果を調査するためのアプローチを提供します。 化学物質曝露の相互作用影響を調査する従来の方法は、特定の生物学的活性との組み合わせに対する特定の病理学的および生理学的反応の検出に依存していました。 別のアプローチは、利用可能な高分解能代謝分析 (22) をバイオインフォマティクス ツールと組み合わせて使用​​し、化学相互作用の代謝効果を全体的な方法で調べることです。 原則として、このアプローチは、数百の代謝産物に対する影響を同時に調べることにより、予期しない相互作用の影響を検出する可能性を提供します。

高分解能代謝解析の開発の指針となる原則は、健康な個人の代謝プロファイルには共通の特徴がある一方で、食事、病気、環境、または遺伝学による毒物学的および病理学的結果がその代謝プロファイルの変動に反映されるということです。 齧歯動物を対象とした研究では、代謝変化の特徴的なパターンが、構造的類似性を持たない化学物質に対する臓器特異的な毒性と関連していることが示されている(23-24)。 このアプローチを人間にも拡張して、健康な代謝プロファイルと不健康な代謝プロファイルを特定できれば、そのようなパターンは、化学混合物や食事と薬物の相互作用に関連する毒性を特定し、診断するための強力な新しいアプローチを提供する可能性があります。 この提案は、健康な成人被験者の代謝パターンにおいて食事療法と薬物の相互作用が検出できるかどうかを判断するためのパイロット研究を実施することです。

私たちは、環境が制御され、特定の化学物質への曝露が変化すると（例：+APAP、+食事性 SAA）、それぞれの曝露に起因すると考えられる代謝変化が観察されると考えています。 高分解能 1H-NMR、液体クロマトグラフィー、質量分析 (MS) は、体液中に多数の代謝物が存在し、多くの代謝物を同時に検出できるため、体液組成の変化を調べるのに適しています。 例は、Nicholson らの研究から入手できます (23、24)。NMR データの多変量統計解析を使用して生体システムの代謝応答を評価する方法は、薬理化合物の毒性学的スクリーニングのために開発中です (25)。 自由生活をしている人間における化学相互作用を検出する原理は同じです。実際、代謝プロファイルの変化は、毒性や病理のリスク状態を非侵襲的に検出する高感度な手段を提供すると期待されています。

尿と血漿の NMR スペクトルの割り当てに関しては、かなりの情報が入手可能です (参考文献 23-25、36-37 など)。この情報は、SAA 摂取量と APAP 曝露の関数として変化する可能性のある代謝産物に対する有用なガイドを提供します。 2-D NMR およびその他の技術をピークの同定に利用できます。 ただし、このプロジェクトの目標では、どの化学種が変化するかを特定する必要はなく、特定の頻度での変化が SAA 摂取量の変動に起因するかどうかだけを確認する必要があります。

意義。 化学相互作用が人間の健康に重大なリスクをもたらすということについては一般的なコンセンサスがありますが、そのようなリスクの特定は依然として非常に困難な問題です。 バイオインフォマティクス手法と組み合わせた詳細な代謝分析は、混乱した代謝プロファイルの観点からそのようなリスクを特定するための潜在的に強力なアプローチを提供します。 しかし、さまざまな個人が消費する食品や医薬品の種類が豊富であるため、信号とノイズを区別し、数百の代謝産物の安定性と回復を検証するというすでに困難な作業が複雑になります。 現在の提案の重要性は、高度に管理された環境および食事条件下で個人内で反復測定を行い、非毒性条件下での化学物質への曝露が、この有望な分析アプローチで検出できるほど十分な代謝の混乱を引き起こすかどうかを判断することである。 この結果は、1H-NMR が人間によく見られる化学物質への曝露や食事摂取量の変動による代謝影響を検出する感度を持っているかどうかを示します。 もしそうであれば、その結果は、 1 H-NMR 分析が化学毒性の影響を研究するためだけでなく、通常の職業条件や治療条件下で発生する化学相互作用による毒性のリスクを研究するためにも使用できることを確立するでしょう。

B. 予備調査:

酸化ストレスを評価するための GSH/GSSG 酸化還元の使用。 この提案は、ヒトにおける GSH 依存性抗酸化システムの制御と機能を理解するための私たちの長年の取り組みに基づいています。 GSH と GSSG のバランスは、酸化ストレスによる酸化のバランスと、GSSG を GSH に還元する NADPH 依存性レダクターゼの能力によって決まります。 ヒト血漿中の GSH とシステインプールの相互作用に関する研究により、GSH 酸化還元特性が酸化プロセスと抗酸化プロセスのバランスの指標として使用するのに適していることが明らかになりました (26)。 さらに、培養中のヒト細胞に関する我々の研究は、GSH/GSSG酸化還元の実質的な変動が細胞の通常のライフサイクル中に発生することを示しており(13、27-28)、本提案の最も中心となるのは、実質的な酸化がCysによって誘導される可能性があることである。欠乏症（29）。 これらの結果は、GSH/GSSG 酸化還元の変動が酸化ストレスの指標であるだけでなく、組織の恒常性の中心である細胞生存/細胞死バランスの指標である可能性があることを示唆しています。 この解釈によれば、GSH/GSSG 酸化還元は根底にある組織の健康状態を反映していることになります。酸化状態は、その酸化が遺伝子異常、栄養欠乏、炎症、または化学物質への曝露によるものであるかどうかに関係なく、毒性の基盤として機能します。 したがって、GSH 酸化またはシステイン利用を引き起こす化学物質への曝露は、システイン摂取量の制限により影響を悪化させるはずです。 a) 硫黄アミノ酸欠乏はチオール/ジスルフィド酸化還元の酸化に関連しており、b) 硫黄アミノ酸は非常に多くの異なる代謝プロセスに必要であり、c) 非常に多くの酵素がチオール/ジスルフィド酸化還元状態の変化の影響を受ける可能性があるため、システインの代謝プロファイルやシステイン依存性経路によって解毒される化学物質の代謝経路からは容易に予測できない、多様な代謝効果が発生する可能性があります。 したがって、現在の提案の中心的な問題は、硫黄SAAの需要を増加させる化学物質への曝露が食事によるSAAの利用可能性と相互作用して、高分解能1H-NMR分光法で検出できる代謝の混乱を引き起こすかどうかである。

GSH/GSSG酸化還元変動の臨床研究。 我々は、43 歳未満 (30 歳) と比較して、60 歳以上の個人ではかなりの酸化 (約 25 mV) が明らかであるという驚くべき発見をしました。 また、糖尿病患者は、既知の疾患のない同様の年齢の人よりも約 20 mV 酸化されていることがわかりました。 追跡調査では、年齢の関数としてのGSH/GSSG酸化還元は二相性であり、45歳未満では明らかな関連性は見られず、50歳以降は年齢に応じて直線的に酸化されることが判明した。 GSH/GSSG酸化還元状態の日内変動に関する我々の研究からの予備データは、夕方と夜間にGSHが増加し、この時間帯に酸化還元状態がより減少したことを示している。 これらの結果は、肝臓のGSHが硫黄アミノ酸摂取に関連する日内変動を受けることを示す齧歯動物の研究と一致しています(31-32)。 これらの結果は、硫黄アミノ酸摂取がヒトの血漿 GSH/GSSG 酸化還元状態の決定因子であるという我々の中心仮説を裏付けています。

ヒトにおけるGSH酸化還元に対する化学物質への曝露の影響。 我々は、血漿GSHおよびCysプールの変化によって検出されるように、化学物質への曝露により硫黄アミノ酸の恒常性が変化することを示す2つの臨床研究を実施しました。 上で示したように、これらのうちの 1 つは、化学療法の結果として GSH 酸化還元がより酸化されることを示しました (33)。 2番目の研究では、タバコを吸う人ではタバコを吸わない人に比べてCysとGSHの両方のプールが酸化していることが示された(34, 38)。 これらの研究を総合すると、化学物質への曝露が Cys と GSH の恒常性の重大な変化を誘発する可能性があることが示されています。

ヒト血漿中のGSHとシステインプールの相互作用。 GSH/GSSG および Cys/CySS プールの相互作用を決定するために、25 ～ 35 歳の健康な個人 24 人の血漿中のチオールおよびジスルフィドの形態が測定されました (26)。 この研究では、GSH 濃度は Cys 濃度と相関しましたが、GSSG と CySS の間、または還元成分と酸化成分の間に相関は観察されませんでした。 これらの値が平衡していないことは、血漿 GSH および Cys 酸化還元値が酸化プロセスと抗酸化プロセスの間の全身バランスの動的な指標であるという解釈を裏付けています (26)。

インビトロでの Cys 欠損は、GSH/GSSG 酸化還元の実質的な酸化を引き起こします。 結腸癌 HT29 細胞株における Cys 欠損と Cys の再添加の研究で、Cys と CySS が低い培地で培養すると、GSH/GSSG 酸化還元状態の 80 mV の酸化に関連して GSH と GSSG が減少することがわかりました (29)。 。 Cys または CySS のいずれかを添加すると、GSH/GSSG の酸化還元は 1 時間で回復しましたが、GSH 濃度は 8 時間にわたって増加し続けました (33)。 これらの結果は現在、Hela 細胞および正常なヒト網膜色素上皮細胞（図示せず）でも確認されており、細胞への Cys 利用可能性の変動が GSH/GSSG 酸化還元状態に一般的な影響を与えることを示しています。

細胞外のチオール/ジスルフィド酸化還元状態が酸化されると、細胞は化学物質による毒性に対して敏感になります。 酸化ストレスは、デスレセプター成分、Fas および Fas リガンドの発現を増加させます (35)。 チオール/ジスルフィドの酸化還元状態の変化が化学毒性に対する感受性に影響を与えるかどうかを判断するために、正常なヒト網膜色素上皮細胞をCysおよびCySS濃度を体系的に変化させた培地で培養し、ヒト血漿中で生体内で見られる酸化還元値の範囲を求めました。酸化剤t-ブチルヒドロペルオキシドで処理されます。 その結果、より還元された酸化還元状態で培養された細胞は、より酸化された酸化還元状態で培養された細胞よりもオキシダント誘導性アポトーシスに対してより耐性があることが示されました。 この効果が他の細胞型や他の化学物質に関してどの程度一般的であるかはまだ明らかではありませんが、この結果は、酸化還元状態の変化自体が毒性に対する感受性の重要な決定要因である可能性を示唆しています。 上記の発見と合わせて、これらの結果は、化学物質への曝露と食事の間の相互作用が検出可能な酸化還元変化を誘導できるかどうか、およびチオール/ジスルフィド酸化還元状態の変化によるさまざまな代謝的影響が高分解能代謝分析によって検出できるかどうかを調査するための強力な正当化を提供します。

ヒト尿の高分解能 1H-NMR。 さまざまな硫黄アミノ酸摂取に応じた代謝変化の測定に適した NMR スペクトルを取得するための装置の感度を調べるために、3 g の Cys を経口摂取しない場合と摂取した場合の連続 2 日間に収集した尿からスペクトルを取得しました。 サンプル(300μl)を、Varian Inova 600MHz分光計でスペクトルを記録する前に、150μlの200mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4および50μlの2H2Oと混合した。 データは結論を出すには予備的すぎますが、結果はスペクトルの品質が Nicholson ら (23-25、36-37) によって報告されたものと同様であり、多数の代謝産物の濃度変化の検出に適していることを示しています。 特に、ニコルソンによって同定されたピークが存在し、追加の Cys を含むサンプルと含まないサンプル間でいくつかの違いが明らかでした。