Effet de l'épuisement des acides aminés soufrés et de l'acétaminophène sur la glutation plasmatique

Les objectifs de cette recherche sont d'évaluer les perturbations toxicologiques du métabolisme dues à des mélanges chimiques complexes et des interactions diététiques-chimiques à l'aide de la RMN 1H à haute résolution. Ces expériences sont conçues pour fournir des données sur l'étendue de la variation normale des profils métaboliques chez les individus en bonne santé et, en combinaison avec des mesures redox clés du GSH, montreront si les changements dus à l'exposition chimique et au régime alimentaire peuvent être discriminés.

Les objectifs spécifiques du protocole actuel sont les suivants :

1. Déterminer si le régime sans SAA (2 jours) et l'APAP (2 doses à 15 mg/kg) modifient indépendamment l'homéostasie et le métabolisme du SAA et l'état redox thiol-disulfure (GSH/GSSG et Cys/CySS).
2. Déterminer si 2 doses d'APAP interagissent avec un régime sans SAA (2 jours) en termes d'effets sur la concentration plasmatique de GSH et l'état redox.
3. Utiliser la spectroscopie RMN 1H pour déterminer si les changements métaboliques induits par l'exposition combinée à un régime sans APAP et SAA sont quantitativement ou qualitativement différents de ceux induits par l'un ou l'autre seul.

A. CONTEXTE ET PORTÉE :

Les acides aminés soufrés sont impliqués dans les processus métaboliques centraux. Les acides aminés soufrés, la méthionine et la cystéine, sont nécessaires à diverses fonctions biologiques essentielles, notamment la synthèse des protéines, la méthylation, le métabolisme des acides gras, la régulation osmotique et la régulation de la division et de la croissance cellulaires (1-5). La méthionine (Met) est un acide aminé essentiel et est métabolisée chez les individus par la voie de transulfuration pour former la cystéine (Cys) (6). En plus d'être utilisés dans la séquence primaire de la plupart des protéines, Met et Cys sont nécessaires pour d'autres fonctions métaboliques. Met est converti en S-adénosylméthionine, qui est utilisée pour les réactions de méthylation (1) pour les modifications structurelles et fonctionnelles des protéines, de l'ARN et de l'ADN, ainsi que la synthèse des phospholipides et des molécules de signalisation. La cystéine est utilisée pour la biosynthèse du glutathion (GSH) et du sulfate (2). GSH fonctionne dans la régulation redox (7) et la détoxification des oxydants et des électrophiles réactifs (8) ; le sulfate est utilisé comme composant structurel des oligosaccharides (3), le transport des hormones stéroïdes (4) et la détoxification des composés étrangers (9). Étant donné que les SAA sont modifiés de manière irréversible dans les processus susmentionnés, il existe une exigence pour un apport adéquat en acides aminés soufrés qui va au-delà du besoin de quantités adéquates pour maintenir la synthèse et le renouvellement normaux des protéines.

L'apport en acides aminés soufrés chez l'homme est variable et l'apport optimal en SAA n'a pas été défini de manière adéquate. L'apport nutritionnel recommandé pour l'AAS est basé sur des études d'équilibre des acides aminés azotés et soufrés et pour un homme adulte est d'environ 1 g (210 mg Met plus 800 mg Met ou Cys) (10,11). Le régime américain moyen contient environ 100 g/j de protéines (2) ; l'apport moyen en SAA est d'environ 2,4 g, mais il existe une grande variation, allant de < 0,3 g à > 5 g (12). La majeure partie du SAA est dérivée de protéines animales, qui constituent environ les 2/3 de l'apport en protéines. À l'exception des légumineuses et de certaines noix, un gramme de protéines d'origine végétale ne contient que 10 à 20 % de la teneur en SAA des protéines animales (13,14). Étant donné que les aliments d'origine végétale ont une faible teneur en protéines totales, les personnes qui ne consomment pas de protéines animales courent un risque de carence en SAA. Le nombre d'Américains ayant un faible apport alimentaire en SAA est relativement faible, mais la plupart des gens subissent des périodes intermittentes de carence en SAA en raison de la sélection des aliments, des régimes, du jeûne et de la maladie. Le contenu non protéique de Cys dans le foie humain est d'environ 1 g, largement présent dans le GSH, et se rapproche des besoins quotidiens en SAA (15).

La désintoxication chimique impose un fardeau sur l'approvisionnement en SAA. La conjugaison au GSH et la conjugaison au sulfate représentent des voies communes et quantitativement importantes pour le métabolisme des composés étrangers. Un exemple, qui est proposé pour une utilisation dans la présente étude, est l'acétaminophène (APAP). Environ 15 % de l'APAP est excrété sous forme de composé d'origine et environ 55 % est métabolisé par conjugaison avec l'acide glucuronique (16-18). Le reste est métabolisé par conjugaison avec du sulfate (25 %) et du GSH (5 %). Si l'on considère le métabolisme de 4 doses d'acétaminophène de force maximale (MW 151), soit 4 g par jour, consommera 200 mg de Cys pendant la conjugaison du GSH et 1 g de Cys pour fournir du sulfate pour la conjugaison (15). Sans sulfate ou sulfite ajouté dans l'alimentation, la majeure partie du sulfate provient de l'AAS alimentaire (2,19). Ainsi, les équivalents totaux de SAA nécessaires au métabolisme de la dose quotidienne maximale d'APAP sont supérieurs à la RDA pour SAA. Ainsi, une interaction entre l'apport en APAP et le déficit en SAA est attendue, et cette interaction peut être significative même à une posologie thérapeutique normale et à un niveau relativement modeste (par exemple, 1 ou 2 jours) d'insuffisance en SAA. Nous proposons que cela fournira un modèle utile pour étudier les interactions chimiques chez l'homme et que les principaux métabolites de l'APAP et de la Cys sont facilement mesurables afin que les effets inverses, l'APAP sur le métabolisme de la SAA et la disponibilité de la SAA sur le métabolisme de l'APAP, puissent être déterminés. La carence en Cys et le métabolisme de l'APAP affectent l'homéostasie du GSH, et notre test clinique pour le GSH redox (7, 20-21) fournit un moyen sensible d'évaluer les effets interactifs de ces 2 manipulations expérimentales.

La RMN 1H haute résolution et la spectrométrie de masse fournissent une approche pour étudier les effets métaboliques complexes de l'alimentation. Les méthodes traditionnelles d'étude des effets interactifs de l'exposition chimique reposent sur la détection de réponses pathologiques et physiologiques spécifiques pour des combinaisons avec des activités biologiques spécifiques. Une approche alternative consiste à utiliser des analyses métaboliques à haute résolution disponibles (22) combinées à des outils bioinformatiques, pour examiner les effets métaboliques des interactions chimiques de manière globale. En principe, en examinant simultanément les effets sur des centaines de métabolites, cette approche offre la possibilité de détecter des effets interactifs imprévus.

Un principe directeur pour le développement d'analyses métaboliques à haute résolution est que les profils métaboliques chez les individus en bonne santé partagent des caractéristiques communes tandis que les conséquences toxicologiques et pathologiques du régime alimentaire, de la maladie, de l'environnement ou de la génétique se reflètent dans les variations de ce profil métabolique. Des études chez les rongeurs montrent que les modèles caractéristiques de changement métabolique sont associés à une toxicité spécifique à un organe pour les agents chimiques qui ne partagent aucune similitude structurelle (23-24). Si cette approche est étendue aux humains pour identifier les profils métaboliques sains et malsains, de tels modèles pourraient fournir une nouvelle approche puissante pour identifier et diagnostiquer les toxicités associées aux mélanges chimiques et aux interactions alimentation-médicament. Cette proposition consiste à mener une étude pilote pour déterminer si les interactions alimentation-médicament peuvent être détectées dans les schémas métaboliques de sujets adultes en bonne santé.

Nous pensons que si l'environnement est contrôlé et que des expositions chimiques spécifiques sont modifiées (par exemple, + APAP, + SAA alimentaire), nous observerons des changements métaboliques qui peuvent être attribués aux expositions respectives. La RMN 1H haute résolution, la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse (MS) sont bien adaptées pour étudier les changements dans la composition des fluides corporels car un grand nombre de métabolites sont présents dans les fluides corporels, de nombreux métabolites peuvent être détectés simultanément. Des exemples sont disponibles dans les études de Nicholson et ses collaborateurs (23, 24). L'utilisation de l'analyse statistique multivariée des données RMN pour évaluer les réponses métaboliques des systèmes vivants est en cours de développement pour le dépistage toxicologique des composés pharmacologiques (25). Les principes de détection des interactions chimiques chez les humains vivant en liberté sont les mêmes; en effet, les modifications du profil métabolique devraient fournir un moyen sensible de détecter de manière non invasive les conditions de risque de toxicité et de pathologie.

Des informations considérables sont disponibles concernant l'attribution des spectres RMN de l'urine et du plasma (par exemple, Ref 23-25, 36-37); ces informations fourniront un guide utile sur les métabolites possibles qui pourraient varier en fonction de l'apport en SAA et de l'exposition à l'APAP. La RMN 2D et d'autres techniques sont disponibles pour l'identification des pics. Cependant, les objectifs de ce projet ne nécessitent pas l'identification des espèces chimiques qui changent, seulement si les changements à des fréquences spécifiques peuvent être attribués à la variation de l'apport en SAA.

Importance. Bien qu'il existe un consensus général sur le fait que les interactions chimiques posent des risques importants pour la santé humaine, l'identification de ces risques reste un problème largement insoluble. Des analyses métaboliques détaillées combinées à des méthodes bioinformatiques fournissent une approche potentiellement puissante pour identifier un tel risque en termes de profil métabolique perturbé. Cependant, la grande variété d'aliments et de médicaments consommés par différents individus complique la tâche déjà difficile de distinguer le signal du bruit et de valider la stabilité et la récupération de centaines de métabolites. L'importance de la proposition actuelle est que nous utiliserons des mesures répétitives chez des individus dans des conditions environnementales et alimentaires hautement contrôlées pour déterminer si l'exposition à un produit chimique dans des conditions non toxiques entraîne une perturbation suffisante du métabolisme pour être détectée par cette approche analytique prometteuse. Les résultats montreront si la RMN 1H a la sensibilité nécessaire pour détecter les effets métaboliques dus aux variations de l'exposition chimique et de l'apport alimentaire qui sont courantes chez l'homme. Si tel est le cas, les résultats établiront que l'analyse 1H-RMN peut être utilisée non seulement pour étudier les conséquences de la toxicité chimique, mais également pour étudier le risque de toxicité due aux interactions chimiques qui se produisent dans les conditions professionnelles et thérapeutiques habituelles.

B. ÉTUDES PRÉLIMINAIRES :

Utilisation du redox GSH/GSSG pour évaluer le stress oxydatif. Cette proposition est basée sur nos efforts de longue date pour comprendre le contrôle et la fonction du système antioxydant dépendant du GSH chez l'homme. L'équilibre entre le GSH et le GSSG est déterminé par l'équilibre de l'oxydation due au stress oxydatif et la capacité de la réductase dépendante du NADPH à réduire le GSSG en GSH. Des études sur les interactions du GSH et des pools de cystéine dans le plasma humain ont révélé que les caractéristiques redox du GSH peuvent être utilisées comme indicateur de l'équilibre entre les processus oxydatifs et antioxydants (26). De plus, nos études de cellules humaines en culture montrent qu'une variation substantielle du redox GSH/GSSG se produit au cours du cycle de vie normal des cellules (13, 27-28) et, ce qui est au cœur de la présente proposition, une oxydation substantielle peut être induite par Cys carence (29). Ces résultats impliquent que la variation du redox GSH/GSSG peut être plus qu'un indicateur de stress oxydatif, elle peut être un indicateur de l'équilibre survie/mort cellulaire qui est au cœur de l'homéostasie tissulaire. Avec cette interprétation, le redox GSH/GSSG reflète la santé des tissus sous-jacents ; un état oxydé sert de plate-forme à la toxicité, que cette oxydation soit due à une anomalie génétique, une carence nutritionnelle, une inflammation ou une exposition chimique. Ainsi, toute exposition chimique entraînant une oxydation du GSH ou l'utilisation de la cystéine devrait exacerber les effets dus à un apport limité en cystéine. Parce que a) une carence en acides aminés soufrés est associée à l'oxydation du thiol/disulfure redox, b) les acides aminés soufrés sont nécessaires pour de nombreux processus métaboliques différents, et c) de nombreuses enzymes sont potentiellement affectées par un changement d'état redox thiol/disulfure, divers effets métaboliques peuvent se produire qui ne sont pas facilement prévisibles à partir du profil métabolique de la cystéine ou des voies métaboliques des produits chimiques détoxifiés par des voies dépendantes de la cystéine. Par conséquent, une question centrale de la proposition actuelle est de savoir si une exposition chimique qui augmente la demande de soufre SAA interagit avec la disponibilité alimentaire de SAA pour produire des perturbations du métabolisme qui peuvent être détectées par spectroscopie 1H-RMN à haute résolution.

Études cliniques de la variation redox GSH/GSSG. Nous avons fait la découverte surprenante qu'une oxydation substantielle (environ 25 mV) était apparente chez les individus > 60 ans par rapport à < 43 ans (30). Nous avons également constaté que les personnes diabétiques étaient environ 20 mV plus oxydées que les personnes du même âge sans maladie connue. Dans une étude de suivi, nous avons constaté que le redox GSH/GSSG en fonction de l'âge était biphasique, sans association apparente avec l'âge inférieur à 45 ans et une oxydation linéaire avec l'âge après 50 ans. Les données préliminaires de notre étude sur la variation diurne de l'état redox du GSH/GSSG montrent qu'il y avait une augmentation du GSH pendant les heures du soir et de la nuit et que l'état redox était plus réduit pendant cette période. Ces résultats sont cohérents avec des études sur des rongeurs montrant que le GSH hépatique subit une variation diurne liée à l'apport en acides aminés soufrés (31-32). Ces résultats appuient notre hypothèse centrale selon laquelle l'apport en acides aminés soufrés est un déterminant de l'état redox plasmatique du GSH/GSSG chez l'homme.

Effets de l'exposition chimique sur le GSH redox chez l'homme. Nous avons réalisé 2 études cliniques qui indiquent que l'exposition chimique modifie l'homéostasie des acides aminés soufrés, comme le détectent les changements dans les pools plasmatiques de GSH et de Cys. Comme indiqué ci-dessus, l'un d'entre eux a montré que le redox du GSH s'oxydait davantage à la suite de la chimiothérapie (33). Une deuxième étude a montré que les pools de Cys et de GSH étaient oxydés chez les personnes qui fumaient des cigarettes par rapport à celles qui ne le faisaient pas (34, 38). Ensemble, ces études indiquent que les expositions chimiques peuvent induire des changements significatifs dans l'homéostasie du Cys et du GSH.

Interactions des pools de GSH et de cystéine dans le plasma humain. Pour déterminer les interactions des pools GSH/GSSG et Cys/CySS, les formes thiol et disulfure ont été mesurées dans le plasma de 24 individus sains âgés de 25 à 35 ans (26). Dans cette étude, la concentration de GSH était corrélée à la concentration de Cys, mais aucune corrélation n'a été observée entre le GSSG et le CySS ou entre les composants réduits et oxydés. Le manque d'équilibrage de ces valeurs soutient l'interprétation selon laquelle les valeurs plasmatiques de GSH et de Cys redox sont des indicateurs dynamiques de l'équilibre systémique entre les processus oxydatifs et antioxydants (26).

La déficience en Cys in vitro entraîne une oxydation substantielle du redox GSH/GSSG. Dans une étude sur la déficience en Cys et la réaddition de Cys dans la lignée cellulaire HT29 du carcinome du côlon, nous avons constaté que la culture dans un milieu à faible Cys et CySS entraînait une diminution du GSH et du GSSG avec une oxydation associée de 80 mV de l'état redox GSH/GSSG (29) . Lors de l'ajout de Cys ou de CySS, le redox de GSH/GSSG a récupéré en 1 h tandis que la concentration de GSH a continué d'augmenter pendant 8 h (33). Ces résultats ont maintenant été confirmés dans les cellules Hela et les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines normales (non présentées), indiquant que la variation de la disponibilité de Cys pour les cellules a un effet général sur l'état redox du GSH/GSSG.

L'oxydation de l'état redox thiol/disulfure extracellulaire sensibilise les cellules à la toxicité induite par les produits chimiques. Le stress oxydatif augmente l'expression des composants du récepteur de la mort, Fas et Fas ligand (35). Pour déterminer si des modifications de l'état redox thiol/disulfure pouvaient affecter la sensibilité à la toxicité chimique, des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines normales ont été cultivées dans des milieux présentant des variations systématiques des concentrations de Cys et de CySS pour donner une gamme de valeurs redox trouvées in vivo dans le plasma humain, puis traité avec l'oxydant t-butylhydroperoxyde. Les résultats ont montré que les cellules cultivées à des états redox plus réduits étaient plus résistantes à l'apoptose induite par l'oxydant que les cellules cultivées à des états redox plus oxydés. Bien que l'on ne sache pas encore à quel point cet effet est général en ce qui concerne d'autres types de cellules et d'autres produits chimiques, les résultats suggèrent que le changement d'état redox, en soi, peut être un déterminant important de la sensibilité à la toxicité. Avec les résultats ci-dessus, ces résultats fournissent une justification solide pour explorer si une interaction entre l'exposition chimique et le régime alimentaire peut induire des changements redox détectables et si diverses conséquences métaboliques de la variation de l'état redox thiol/disulfure peuvent être détectées par une analyse métabolique à haute résolution.

RMN 1H haute résolution de l'urine humaine. Afin d'examiner la sensibilité de notre instrumentation pour obtenir des spectres RMN adaptés aux mesures des changements métaboliques en réponse à des apports variés en acides aminés soufrés, nous avons obtenu des spectres d'urine prélevés sur 2 jours successifs sans et avec supplémentation orale avec 3 g de Cys. Les échantillons (300 μl) ont été mélangés avec 150 μl de tampon phosphate de sodium 200 mM, pH 7,4, et 50 μl de 2H2O avant l'enregistrement des spectres avec un spectromètre Varian Inova 600 MHz. Bien que les données soient trop préliminaires pour tirer des conclusions, les résultats démontrent que la qualité spectrale est similaire à celle rapportée par Nicholson et ses collègues (23-25, 36-37) et adaptée à la détection des changements de concentrations d'un grand nombre de métabolites. En particulier, les pics identifiés par Nicholson étaient présents et plusieurs différences étaient évidentes entre les échantillons avec Cys supplémentaire et sans.