Влияние истощения аминокислот серы и ацетаминофена на глутатион плазмы

Цели этого исследования заключаются в оценке токсикологических нарушений метаболизма из-за сложных химических смесей и взаимодействий между пищей и химическими веществами с использованием 1H-ЯМР высокого разрешения. Эти эксперименты предназначены для получения данных о степени нормальных вариаций метаболических профилей у здоровых людей и, в сочетании с ключевыми измерениями окислительно-восстановительного потенциала GSH, покажут, можно ли различить изменения, вызванные химическим воздействием и диетой.

Конкретными целями текущего протокола являются:

1. Определить, изменяют ли диета без SAA (2 дня) и APAP (2 дозы по 15 мг/кг) независимо друг от друга гомеостаз и метаболизм SAA, а также окислительно-восстановительное состояние тиолдисульфидов (GSH/GSSG и Cys/CySS).
2. Определить, взаимодействуют ли 2 дозы APAP с диетой, не содержащей SAA (2 дня), влияя на концентрацию GSH в плазме и окислительно-восстановительное состояние.
3. Использовать 1H-ЯМР-спектроскопию, чтобы определить, отличаются ли метаболические изменения, вызванные комбинированным воздействием APAP и диеты без SAA, количественно или качественно, от изменений, вызванных каждым из них по отдельности.

А. ПРЕДПОСЫЛКИ И ЗНАЧЕНИЕ:

Серные аминокислоты участвуют в центральных метаболических процессах. Серосодержащие аминокислоты, метионин и цистеин, необходимы для разнообразных критических биологических функций, включая синтез белка, метилирование, метаболизм жирных кислот, осмотическую регуляцию и регуляцию клеточного деления и роста (1-5). Метионин (Met) является незаменимой аминокислотой и метаболизируется у людей путем транссульфурации с образованием цистеина (Cys) (6). Помимо использования в первичной последовательности большинства белков, как Met, так и Cys необходимы для других метаболических функций. Met превращается в S-аденозилметионин, который используется в реакциях метилирования (1) для структурных и функциональных модификаций белков, РНК и ДНК, а также для синтеза фосфолипидов и сигнальных молекул. Цистеин используется для биосинтеза глутатиона (GSH) и сульфата (2). GSH участвует в окислительно-восстановительной регуляции (7) и детоксикации оксидантов и реактивных электрофилов (8); сульфат используется в качестве структурного компонента олигосахаридов (3), транспорта стероидных гормонов (4) и детоксикации чужеродных соединений (9). Поскольку SAA необратимо модифицируются в вышеупомянутых процессах, существует потребность в адекватном потреблении серосодержащих аминокислот, которая выходит за рамки потребности в адекватных количествах для поддержания нормального синтеза и обмена белка.

Потребление аминокислоты серы у людей вариабельно, а оптимальное потребление SAA адекватно не определено. Рекомендуемая суточная доза для SAA основана на исследованиях баланса азота и серы и аминокислот и составляет для взрослого мужчины около 1 г (210 мг Met плюс 800 мг Met или Cys) (10,11). В рационе среднего американца содержится около 100 г белка в день (2); среднее потребление ПАВ составляет около 2,4 г, но существует большая вариация от < 0,3 г до > 5 г (12). Большая часть SAA получена из животного белка, который составляет около 2/3 потребляемого белка. За исключением бобовых и некоторых орехов, грамм белка растительного происхождения содержит только 10-20% содержания SAA в белке животного происхождения (13,14). Поскольку продукты растительного происхождения содержат мало общего белка, люди, которые не потребляют животные белки, подвержены риску дефицита SAA. Число американцев с низким потреблением SAA с пищей относительно невелико, но у большинства людей периодически возникают периоды дефицита SAA из-за выбора продуктов питания, диеты, голодания и болезней. Небелковое содержание Cys в печени человека составляет около 1 г, в основном присутствует в GSH и приблизительно соответствует суточной потребности SAA (15).

Химическая детоксикация накладывает нагрузку на поступление SAA. Конъюгация GSH и конъюгация сульфата представляют собой общие и количественно важные пути метаболизма чужеродных соединений. Одним из примеров, который предлагается использовать в настоящем исследовании, является ацетаминофен (АПАР). Около 15% АРАР выводится из организма в виде исходного соединения и около 55% метаболизируется путем конъюгации с глюкуроновой кислотой (16-18). Остаток метаболизируется путем конъюгации с сульфатом (25%) и GSH (5%). Если принять во внимание метаболизм 4 доз ацетаминофена максимальной силы (MW 151), то есть 4 г в день, будет потребляться 200 мг Cys во время конъюгации GSH и 1 г Cys для обеспечения сульфата для конъюгации (15). Без добавления сульфата или сульфита в рацион большая часть сульфата поступает из пищевых SAA (2,19). Таким образом, общие эквиваленты SAA, необходимые для метаболизма максимальной суточной дозы APAP, превышают RDA для SAA. Таким образом, ожидается взаимодействие между потреблением APAP и дефицитом SAA, и это взаимодействие может быть значительным даже при нормальной терапевтической дозировке и относительно умеренном уровне (например, 1 или 2 дня) недостаточности SAA. Мы предполагаем, что это обеспечит полезную модель для исследования химических взаимодействий у людей, а основные метаболиты APAP и Cys легко поддаются измерению, чтобы можно было определить обратные эффекты, APAP на метаболизм SAA и доступность SAA на метаболизм APAP. Как дефицит Cys, так и метаболизм APAP влияют на гомеостаз GSH, и наш клинический анализ окислительно-восстановительного потенциала GSH (7, 20-21) обеспечивает чувствительные средства для оценки интерактивных эффектов этих двух экспериментальных манипуляций.

1H-ЯМР высокого разрешения и масс-спектрометрия позволяют исследовать сложные метаболические эффекты диеты. Традиционные методы исследования интерактивных эффектов химического воздействия основывались на обнаружении специфических патологических и физиологических реакций на комбинации с специфической биологической активностью. Альтернативный подход заключается в использовании доступных метаболических анализов с высоким разрешением (22) в сочетании с биоинформационными инструментами для глобального изучения метаболических эффектов химических взаимодействий. В принципе, при одновременном изучении воздействия на сотни метаболитов этот подход дает возможность обнаружить непредвиденные интерактивные эффекты.

Руководящим принципом для разработки метаболических анализов с высоким разрешением является то, что метаболические профили у здоровых людей имеют общие черты, в то время как токсикологические и патологические последствия диеты, болезней, окружающей среды или генетики отражаются в вариациях этого метаболического профиля. Исследования на грызунах показывают, что характерные закономерности метаболических изменений связаны с органоспецифической токсичностью химических агентов, которые не имеют структурного сходства (23-24). Если этот подход будет распространен на людей для выявления здоровых и нездоровых метаболических профилей, такие закономерности могут стать мощным новым подходом к выявлению и диагностике токсичности, связанной с химическими смесями и взаимодействиями диеты и лекарств. Это предложение состоит в том, чтобы провести пилотное исследование, чтобы определить, можно ли обнаружить взаимодействие диеты и лекарств в метаболических моделях здоровых взрослых людей.

Мы считаем, что если окружающая среда находится под контролем и изменены конкретные химические воздействия (например, +APAP, +пищевые SAA), мы будем наблюдать метаболические изменения, которые можно отнести к соответствующим воздействиям. 1H-ЯМР высокого разрешения, жидкостная хроматография и масс-спектрометрия (МС) хорошо подходят для исследования изменений в составе жидкостей организма, поскольку в жидкостях организма присутствует большое количество метаболитов, многие метаболиты могут быть обнаружены одновременно. Примеры можно найти в исследованиях Николсона и его сотрудников (23, 24). Использование многомерного статистического анализа данных ЯМР для оценки метаболических реакций живых систем находится в стадии разработки для токсикологического скрининга фармакологических соединений (25). Принципы обнаружения химических взаимодействий у свободноживущих людей те же; на самом деле ожидается, что изменения в метаболическом профиле обеспечат чувствительные средства для неинвазивного обнаружения условий риска токсичности и патологии.

Доступен значительный объем информации относительно отнесения спектров ЯМР мочи и плазмы (например, ссылки 23-25, 36-37); эта информация предоставит полезное руководство по возможным метаболитам, которые могут варьироваться в зависимости от потребления SAA и воздействия APAP. Для идентификации пиков доступны двумерный ЯМР и другие методы. Тем не менее, цели этого проекта не требуют определения того, какие химические соединения изменяются, а требуют только того, могут ли изменения с определенной частотой быть связаны с изменением потребления SAA.

Значение. Хотя существует общее мнение, что химические взаимодействия представляют значительный риск для здоровья человека, выявление такого риска остается в значительной степени неразрешимой проблемой. Детальный метаболический анализ в сочетании с биоинформационными методами обеспечивает потенциально мощный подход к выявлению такого риска с точки зрения нарушенного метаболического профиля. Однако большое разнообразие пищевых продуктов и лекарств, потребляемых разными людьми, усложняет и без того сложную задачу по различению сигнала и шума и проверке стабильности и восстановления для сотен метаболитов. Значение текущего предложения заключается в том, что мы будем использовать повторяющиеся измерения у людей в строго контролируемых условиях окружающей среды и питания, чтобы определить, приводит ли воздействие химического вещества в нетоксичных условиях к достаточному нарушению метаболизма, чтобы его можно было обнаружить с помощью этого многообещающего аналитического подхода. Результаты покажут, обладает ли 1H-ЯМР чувствительностью для обнаружения метаболических эффектов из-за различий в химическом воздействии и пищевом рационе, которые распространены среди людей. Если да, то результаты показывают, что анализ 1Н-ЯМР можно использовать не только для изучения последствий химической токсичности, но и для изучения риска токсичности вследствие химических взаимодействий, происходящих в обычных профессиональных и терапевтических условиях.

Б. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Использование окислительно-восстановительного потенциала GSH/GSSG для оценки окислительного стресса. Это предложение основано на наших давних усилиях по пониманию контроля и функции GSH-зависимой антиоксидантной системы у людей. Баланс между GSH и GSSG определяется балансом окисления из-за окислительного стресса и способностью НАДФН-зависимой редуктазы восстанавливать GSSG обратно до GSH. Исследования взаимодействия пулов GSH и цистеина в плазме человека показали, что окислительно-восстановительные характеристики GSH подходят для использования в качестве индикатора баланса между окислительными и антиоксидантными процессами (26). Кроме того, наши исследования клеток человека в культуре показывают, что значительные вариации окислительно-восстановительного потенциала GSH/GSSG происходят во время нормального жизненного цикла клеток (13, 27-28), и, что наиболее важно в настоящем предложении, существенное окисление может быть вызвано Cys. дефицит (29). Эти результаты подразумевают, что изменение окислительно-восстановительного потенциала GSH/GSSG может быть больше, чем индикатор окислительного стресса, это может быть индикатором баланса между выживанием и гибелью клеток, который играет центральную роль в тканевом гомеостазе. При такой интерпретации окислительно-восстановительный потенциал GSH/GSSG отражает здоровье основной ткани; окисленное состояние служит платформой для токсичности независимо от того, вызвано ли это окисление генетической аномалией, дефицитом питательных веществ, воспалением или химическим воздействием. Таким образом, любое химическое воздействие, которое приводит к окислению GSH или утилизации цистеина, должно усугублять последствия ограниченного потребления цистеина. Поскольку а) дефицит сернистых аминокислот связан с окислением окислительно-восстановительного состояния тиолов/дисульфидов, б) серосодержащие аминокислоты необходимы для многих различных метаболических процессов и в) многие ферменты потенциально подвержены влиянию изменения окислительно-восстановительного состояния тиолов/дисульфидов, могут возникать различные метаболические эффекты, которые трудно предсказать по метаболическому профилю цистеина или по метаболическим путям детоксикации химических веществ цистеин-зависимыми путями. Следовательно, центральный вопрос текущего предложения заключается в том, взаимодействует ли химическое воздействие, которое увеличивает потребность в сернистых ПАВ, с доступностью ПАВ в рационе, вызывая нарушения метаболизма, которые можно обнаружить с помощью 1Н-ЯМР-спектроскопии высокого разрешения.

Клинические исследования окислительно-восстановительных изменений GSH/GSSG. Мы сделали неожиданное открытие, что существенное окисление (приблизительно 25 мВ) было очевидным у лиц старше 60 лет по сравнению с лицами моложе 43 лет (30). Мы также обнаружили, что люди с диабетом были примерно на 20 мВ более окислены, чем люди того же возраста без известных заболеваний. В последующем исследовании мы обнаружили, что окислительно-восстановительный потенциал GSH/GSSG в зависимости от возраста был двухфазным, без очевидной связи с возрастом до 45 лет и линейным окислением с возрастом после 50 лет. Предварительные данные нашего исследования суточных изменений окислительно-восстановительного состояния GSH/GSSG показывают, что в вечерние и ночные часы наблюдалось увеличение GSH и что окислительно-восстановительное состояние было более сниженным в этот период времени. Эти результаты согласуются с исследованиями на грызунах, показывающими, что печеночный GSH подвергается суточным колебаниям, связанным с потреблением серосодержащих аминокислот (31-32). Эти результаты подтверждают нашу основную гипотезу о том, что потребление сернистых аминокислот является определяющим фактором окислительно-восстановительного состояния GSH/GSSG в плазме у людей.

Влияние химического воздействия на окислительно-восстановительный потенциал GSH у людей. Мы провели 2 клинических исследования, которые показали, что химическое воздействие изменяет гомеостаз серо-аминокислот, о чем свидетельствуют изменения в пулах GSH и Cys в плазме. Как указывалось выше, один из них показал, что окислительно-восстановительный потенциал GSH стал более окисленным вследствие химиотерапии (33). Второе исследование показало, что пулы Cys и GSH окислялись у людей, которые курили сигареты, по сравнению с теми, кто не курил (34, 38). В совокупности эти исследования показывают, что химическое воздействие может вызывать значительные изменения в гомеостазе Cys и GSH.

Взаимодействие пулов GSH и цистеина в плазме человека. Чтобы определить взаимодействие пулов GSH/GSSG и Cys/CySS, тиоловые и дисульфидные формы были измерены в плазме 24 здоровых людей в возрасте 25-35 лет (26). В этом исследовании концентрация GSH коррелировала с концентрацией Cys, но корреляции между GSSG и CySS или между восстановленными и окисленными компонентами не наблюдалось. Отсутствие уравновешивания этих значений подтверждает интерпретацию того, что значения GSH и окислительно-восстановительного потенциала Cys в плазме являются динамическими индикаторами системного баланса между окислительными и антиоксидантными процессами (26).

Дефицит Cys in vitro приводит к существенному окислению окислительно-восстановительного потенциала GSH/GSSG. В исследовании дефицита Cys и повторного добавления Cys в клеточной линии карциномы толстой кишки HT29 мы обнаружили, что культивирование в среде с низким содержанием Cys и CySS приводит к снижению GSH и GSSG с сопутствующим окислением окислительно-восстановительного состояния GSH/GSSG на 80 мВ (29) . При добавлении либо Cys, либо CySS окислительно-восстановительный потенциал GSH/GSSG восстанавливался через 1 час, в то время как концентрация GSH продолжала увеличиваться в течение 8 часов (33). Эти результаты теперь подтверждены в клетках Hela и нормальных клетках пигментного эпителия сетчатки человека (не показаны), что указывает на то, что изменение доступности Cys клеткам оказывает общее влияние на окислительно-восстановительное состояние GSH/GSSG.

Окисление внеклеточного окислительно-восстановительного состояния тиола/дисульфида делает клетки чувствительными к химически индуцированной токсичности. Окислительный стресс увеличивает экспрессию компонентов рецептора смерти, Fas и лиганда Fas (35). Чтобы определить, могут ли изменения в окислительно-восстановительном состоянии тиол/дисульфид влиять на чувствительность к химической токсичности, нормальные клетки пигментного эпителия сетчатки человека культивировали в среде с систематическими изменениями концентраций Cys и CySS, чтобы получить диапазон значений окислительно-восстановительного потенциала, обнаруженных in vivo в плазме человека, а затем обрабатывают окислителем трет-бутилгидропероксидом. Результаты показали, что клетки, культивированные в более восстановленных окислительно-восстановительных состояниях, были более устойчивы к апоптозу, вызванному окислителем, чем клетки, культивированные в более окисленных окислительно-восстановительных состояниях. Хотя еще не ясно, насколько общим является этот эффект по отношению к другим типам клеток и другим химическим веществам, результаты показывают, что изменение окислительно-восстановительного состояния само по себе может быть важным фактором, определяющим восприимчивость к токсичности. Вместе с приведенными выше выводами эти результаты дают веские основания для изучения того, может ли взаимодействие между химическим воздействием и диетой вызывать обнаруживаемые окислительно-восстановительные изменения и могут ли разнообразные метаболические последствия изменения окислительно-восстановительного состояния тиолов/дисульфидов быть обнаружены с помощью метаболического анализа с высоким разрешением.

1H-ЯМР высокого разрешения мочи человека. Чтобы проверить чувствительность нашего оборудования для получения спектров ЯМР, подходящих для измерения метаболических изменений в ответ на различное потребление аминокислот серы, мы получили спектры мочи, собранной в течение 2 дней подряд без и с пероральным добавлением 3 г Cys. Образцы (300 мкл) смешивали со 150 мкл 200 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, и 50 мкл 2H2O перед регистрацией спектров на спектрометре Varian Inova 600 МГц. Хотя данные слишком предварительны, чтобы делать выводы, результаты показывают, что спектральное качество аналогично тому, о котором сообщают Николсон и его коллеги (23–25, 36–37), и подходит для обнаружения изменений концентраций большого количества метаболитов. В частности, присутствовали пики, идентифицированные Николсоном, и были очевидны некоторые различия между образцами с дополнительным Cys и без него.