A kén-aminosav-kiürítés és az acetaminofen hatása a plazma glutationre

A kutatás célja az anyagcsere toxikológiai zavarainak értékelése összetett kémiai keverékek és étrend-kémiai kölcsönhatások miatt nagy felbontású 1H-NMR segítségével. Ezeket a kísérleteket arra tervezték, hogy adatokat szolgáltassanak az egészséges egyének anyagcsereprofiljaiban bekövetkező normális eltérések mértékéről, és a kulcsfontosságú GSH redox mérésekkel kombinálva megmutatják, hogy a kémiai expozíció és az étrend miatti változások megkülönböztethetők-e.

A jelenlegi protokoll konkrét céljai a következők:

1. Annak meghatározása, hogy az SAA-mentes diéta (2 nap) és az APAP (2 adag 15 mg/kg-ban) egymástól függetlenül megváltoztatja-e az SAA homeosztázist és metabolizmust, valamint a tiol-diszulfid redox állapotot (GSH/GSSG és Cys/CySS).
2. Annak meghatározása, hogy 2 adag APAP kölcsönhatásba lép-e az SAA-mentes diétával (2 nap) a plazma GSH-koncentrációjára és a redoxállapotra gyakorolt ​​​​hatással.
3. 1H-NMR spektroszkópia alkalmazása annak meghatározására, hogy az APAP és az SAA-mentes diéta kombinált expozíciója által kiváltott metabolikus változások mennyiségileg vagy minőségileg eltérnek-e azoktól, amelyeket bármelyik önmagában indukál.

A. HÁTTÉR ÉS JELENTŐSÉG:

A kén aminosavak részt vesznek a központi anyagcsere folyamatokban. A kéntartalmú aminosavak, a metionin és a cisztein különféle, kritikus biológiai funkciókhoz szükségesek, beleértve a fehérjeszintézist, a metilációt, a zsírsav-anyagcserét, az ozmotikus szabályozást, valamint a sejtosztódás és -növekedés szabályozását (1-5). A metionin (Met) esszenciális aminosav, és az egyénekben a transzszulfurációs úton metabolizálódik, és ciszteinné (Cys) keletkezik (6). A legtöbb fehérje elsődleges szekvenciájában való felhasználás mellett a Met és a Cys is szükséges más metabolikus funkciókhoz. A Met átalakul S-adenozil-metioninná, amelyet metilezési reakciókban (1) használnak a fehérjék, RNS és DNS szerkezeti és funkcionális módosításaihoz, valamint foszfolipidek és jelátviteli molekulák szintéziséhez. A ciszteint a glutation (GSH) és a szulfát bioszintézisére használják (2). A GSH szerepet játszik a redox szabályozásban (7) és az oxidálószerek és a reaktív elektrofilek méregtelenítésében (8); A szulfátot az oligoszacharidok (3), a szteroid hormonok szállítása (4) és az idegen vegyületek méregtelenítése (9) szerkezeti összetevőjeként használják. Mivel az SAA-k visszafordíthatatlanul módosulnak a fent említett folyamatokban, szükség van a megfelelő kén-aminosav-bevitelre, amely túlmutat a normál fehérjeszintézis és -forgalom fenntartásához szükséges megfelelő mennyiségeken.

A kén aminosav bevitele emberekben változó, és az optimális SAA bevitelt nem határozták meg megfelelően. Az SAA ajánlott étrendi mennyisége a nitrogén- és kén-aminosav-egyensúlyi vizsgálatokon alapul, és egy felnőtt férfi esetében körülbelül 1 g (210 mg Met plusz 800 mg Met vagy Cys) (10,11). Az átlagos amerikai étrend körülbelül 100 g/nap fehérjét tartalmaz (2); az átlagos SAA-bevitel körülbelül 2,4 g, de nagy eltérések mutatkoznak, 0,3 g-tól > 5 g-ig (12). Az SAA nagy része állati fehérjéből származik, amely a fehérjebevitel körülbelül 2/3-át teszi ki. A hüvelyesek és egyes diófélék kivételével egy gramm növényi eredetű fehérje az állati fehérje SAA-tartalmának csak 10-20%-át tartalmazza (13,14). Mivel a növényi eredetű élelmiszerek összes fehérjetartalma alacsony, az állati fehérjét nem fogyasztó egyének ki vannak téve az SAA-hiány kockázatának. Viszonylag alacsony azoknak az amerikaiaknak a száma, akik kevés SAA-t fogyasztanak, de a legtöbb ember időszakosan SAA-hiányon megy keresztül az élelmiszerválasztás, a diéta, a koplalás és a betegségek miatt. A Cys nem fehérjetartalma az emberi májban körülbelül 1 g, nagyrészt jelen van a GSH-ban, és megközelíti a napi SAA-szükségletet (15).

A kémiai méregtelenítés megterheli az SAA-ellátást. A GSH-konjugáció és a szulfát-konjugáció az idegen vegyületek metabolizmusának gyakori és mennyiségileg fontos útja. Az egyik példa, amelyet a jelen tanulmányban felhasználásra javasolnak, az acetaminofen (APAP). Az APAP körülbelül 15%-a kiválasztódik kiindulási vegyületként, és körülbelül 55%-a metabolizálódik glükuronsavval konjugálva (16-18). A fennmaradó rész szulfáttal (25%) és GSH-val (5%) konjugálva metabolizálódik. Ha figyelembe vesszük 4 adag maximális erősségű acetaminofen (MW 151), azaz napi 4 g metabolizmusát, akkor 200 mg Cys-t fogyasztunk a GSH-konjugáció során és 1 g Cys-t a konjugációhoz szükséges szulfát biztosításához (15). Szulfát vagy szulfit hozzáadása nélkül az étrendben a szulfát nagy része az étrendi SAA-ból származik (2,19). Így az APAP maximális napi dózisának metabolizmusához szükséges SAA teljes egyenértéke nagyobb, mint az SAA RDA. Így kölcsönhatás várható az APAP-bevitel és az SAA-hiány között, és ez a kölcsönhatás még normál terápiás adagolás és viszonylag szerény szintű (például 1 vagy 2 napos) SAA-elégtelenség esetén is jelentős lehet. Javasoljuk, hogy ez hasznos modellt biztosítson a kémiai kölcsönhatások emberben történő vizsgálatához, és az APAP és Cys fő metabolitjai könnyen mérhetők, így az ellentétes hatások, az APAP az SAA metabolizmusára és az SAA elérhetősége az APAP metabolizmusára, meghatározhatók. Mind a Cys-hiány, mind az APAP metabolizmus befolyásolja a GSH homeosztázist, és a GSH redoxra vonatkozó klinikai vizsgálatunk (7, 20-21) érzékeny eszközt kínál e két kísérleti manipuláció interaktív hatásainak értékelésére.

A nagy felbontású 1H-NMR és tömegspektrometria megközelítést kínál az étrend összetett metabolikus hatásainak vizsgálatára. A kémiai expozíció interaktív hatásainak vizsgálatára szolgáló hagyományos módszerek a specifikus kóros és fiziológiai válaszok kimutatásán alapulnak specifikus biológiai aktivitásokkal kombinálva. Egy másik megközelítés a rendelkezésre álló nagy felbontású metabolikus elemzések (22) és bioinformatikai eszközökkel kombinálva a kémiai kölcsönhatások metabolikus hatásainak globális vizsgálata. Elvileg a több száz metabolitra gyakorolt ​​hatás egyidejű vizsgálatával ez a megközelítés lehetőséget biztosít a nem várt interaktív hatások kimutatására.

A nagy felbontású metabolikus elemzések kidolgozásának vezérelve az, hogy az egészséges egyének metabolikus profilja közös vonásokkal rendelkezik, míg az étrend, a betegség, a környezet vagy a genetika toxikológiai és kóros következményei az anyagcsere-profil eltéréseiben tükröződnek. A rágcsálókon végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a metabolikus változások jellegzetes mintázatai olyan kémiai anyagok szervspecifikus toxicitásával járnak, amelyeknek nincs szerkezeti hasonlósága (23-24). Ha ezt a megközelítést az emberekre is kiterjesztik az egészséges és egészségtelen metabolikus profilok azonosítására, az ilyen minták hatékony új megközelítést jelenthetnek a kémiai keverékekkel és az étrend-gyógyszer kölcsönhatásokkal kapcsolatos toxicitások azonosítására és diagnosztizálására. Ez a javaslat egy kísérleti vizsgálat elvégzésére irányul annak meghatározására, hogy az étrend-gyógyszer kölcsönhatások kimutathatók-e egészséges felnőtt alanyok anyagcsere-mintázataiban.

Úgy gondoljuk, hogy ha a környezetet szabályozzák, és a specifikus kémiai expozíciókat megváltoztatják (pl. +APAP, +diétás SAA), akkor az adott expozíciónak tulajdonítható anyagcsere-változásokat figyeljük meg. A nagyfelbontású 1H-NMR, folyadékkromatográfia és tömegspektrometria (MS) kiválóan alkalmas a testfolyadék-összetétel változásának vizsgálatára, mivel a testfolyadékokban nagyszámú metabolit van jelen, sok metabolit egyidejűleg kimutatható. Példák állnak rendelkezésre Nicholson és munkatársai tanulmányaiból (23, 24). Az NMR adatok többváltozós statisztikai elemzésének alkalmazása az élő rendszerek metabolikus válaszainak értékelésére fejlesztés alatt áll a farmakológiai vegyületek toxikológiai szűrésére (25). A szabadon élő embereknél a kémiai kölcsönhatások kimutatásának elvei ugyanazok; valójában a metabolikus profil változásai várhatóan érzékeny eszközt jelentenek a toxicitás és a patológia kockázatának nem invazív kimutatására.

Jelentős információ áll rendelkezésre a vizelet és a plazma NMR-spektrumainak hozzárendeléséről (pl. 23-25., 36-37. hivatkozás); ez az információ hasznos útmutatót nyújt a lehetséges metabolitokhoz, amelyek az SAA-bevitel és az APAP-expozíció függvényében változhatnak. 2-D NMR és más technikák állnak rendelkezésre a csúcsok azonosítására. Ennek a projektnek a céljai azonban nem azt követelik meg, hogy mely kémiai fajok változnak, csak azt, hogy a meghatározott gyakoriságú változások a SAA-bevitel változásának tulajdoníthatók-e.

Jelentőség. Noha általános az egyetértés abban, hogy a kémiai kölcsönhatások jelentős emberi egészségi kockázatot jelentenek, az ilyen kockázat azonosítása továbbra is nagyrészt megoldhatatlan probléma. A részletes metabolikus elemzések bioinformatikai módszerekkel kombinálva potenciálisan hatékony megközelítést biztosítanak az ilyen kockázatok azonosítására a megzavart metabolikus profil tekintetében. A különböző egyének által fogyasztott élelmiszerek és gyógyszerek nagy változatossága azonban megnehezíti a jel és a zaj megkülönböztetésének, valamint a több száz metabolit stabilitásának és helyreállításának az amúgy is nehéz feladatát. A jelenlegi javaslat jelentősége abban áll, hogy ismétlődő intézkedéseket fogunk alkalmazni erősen ellenőrzött környezeti és táplálkozási feltételek mellett, annak megállapítására, hogy egy vegyi anyagnak való kitettség nem mérgező körülmények között elegendő mértékben zavarja-e az anyagcserét ahhoz, hogy ezzel az ígéretes analitikai megközelítéssel kimutatható legyen. Az eredmények megmutatják, hogy az 1H-NMR érzékeny-e a metabolikus hatások kimutatására a vegyi expozíció és a táplálékfelvétel embereknél gyakori eltérései miatt. Ha igen, az eredmények azt mutatják, hogy az 1H-NMR elemzés nemcsak a kémiai toxicitás következményeinek tanulmányozására használható, hanem a szokásos foglalkozási és terápiás körülmények között előforduló kémiai kölcsönhatások miatti toxicitás kockázatának tanulmányozására is.

B. ELŐZETES TANULMÁNYOK:

A GSH/GSSG redox használata az oxidatív stressz értékelésére. Ez a javaslat azon a régóta tartó erőfeszítéseinken alapul, hogy megértsük a GSH-függő antioxidáns rendszer szabályozását és működését az emberekben. A GSH és a GSSG közötti egyensúlyt az oxidatív stressz okozta oxidáció egyensúlya és a NADPH-függő reduktáz azon képessége határozza meg, hogy a GSSG-t GSH-vá redukálja vissza. A humán plazmában a GSH és a cisztein poolok kölcsönhatásait vizsgáló tanulmányok kimutatták, hogy a GSH redox jellemzői alkalmasak az oxidatív és antioxidáns folyamatok közötti egyensúly indikátoraként való használatra (26). Ezen túlmenően a humán sejtekkel végzett tenyészetekben végzett vizsgálataink azt mutatják, hogy a GSH/GSSG redox jelentős változása a sejtek normál életciklusa során fordul elő (13, 27-28), és ami a jelen javaslatban a legfontosabb, a Cys jelentős oxidációt válthat ki. hiányosság (29). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a GSH/GSSG redox változása több lehet, mint az oxidatív stressz indikátora, hanem a sejttúlélés/sejthalál egyensúly mutatója is lehet, amely központi szerepet játszik a szöveti homeosztázisban. Ezzel az értelmezéssel a GSH/GSSG redox a mögöttes szövetek egészségét tükrözi; az oxidált állapot a toxicitás platformjaként szolgál, függetlenül attól, hogy ezt az oxidációt genetikai rendellenesség, táplálkozási hiány, gyulladás vagy vegyi expozíció okozza. Így minden kémiai expozíció, amely GSH oxidációt vagy cisztein felhasználást eredményez, súlyosbítja a hatásokat a korlátozott cisztein bevitel miatt. Mivel a) a kén-aminosav-hiány a tiol/diszulfid-redox oxidációjával jár, b) a kén-aminosavak nagyon sok különböző anyagcsere-folyamathoz szükségesek, és c) a tiol/diszulfid-redox állapot változása potenciálisan sok enzimet érint, változatos metabolikus hatások léphetnek fel, amelyek a cisztein metabolikus profiljából vagy a ciszteinfüggő utak által méregtelenített vegyi anyagok anyagcsereútjaiból nem egyértelműen előre jelezhetők. Ezért a jelenlegi javaslat központi kérdése az, hogy a kén-SAA iránti keresletet növelő kémiai expozíció kölcsönhatásba lép-e az SAA étrendi elérhetőségével, és ezáltal olyan anyagcserezavarokat idéz elő, amelyek nagy felbontású 1H-NMR spektroszkópiával kimutathatók.

A GSH/GSSG redox variáció klinikai vizsgálata. Meglepő megállapítást tettünk, hogy jelentős oxidáció (körülbelül 25 mV) volt látható a 60 év feletti egyéneknél, míg a 43 évnél idősebbeknél (30). Azt is megállapítottuk, hogy a cukorbetegek körülbelül 20 mV-tal oxidáltabbak voltak, mint a hasonló korú, ismert betegségben nem szenvedő egyének. Egy nyomon követéses vizsgálat során azt találtuk, hogy a GSH/GSSG redox az életkor függvényében kétfázisú volt, nincs nyilvánvaló összefüggés a 45 év alatti életkorral, és lineáris oxidáció az életkorral 50 év után. A GSH/GSSG redox státusz napi változásaira vonatkozó vizsgálatunk előzetes adatai azt mutatják, hogy a GSH emelkedett az esti és éjszakai órákban, és hogy a redox állapot jobban csökkent ebben az időszakban. Ezek az eredmények összhangban vannak a rágcsálókon végzett vizsgálatokkal, amelyek azt mutatják, hogy a hepatikus GSH a kén-aminosav-bevitellel összefüggő napi változáson megy keresztül (31-32). Ezek az eredmények alátámasztják központi hipotézisünket, miszerint a kén-aminosav bevitel a plazma GSH/GSSG redox állapotának meghatározója emberben.

A kémiai expozíció hatása a GSH-redoxra emberekben. 2 klinikai vizsgálatot végeztünk, amelyek azt mutatják, hogy a kémiai expozíció megváltoztatja a kén-aminosav homeosztázist, amit a plazma GSH és Cys pool változásai mutatnak ki. Amint azt fentebb jeleztük, ezek egyike azt mutatta, hogy a GSH-redox oxidáltabbá vált a kemoterápia következtében (33). Egy második tanulmány kimutatta, hogy a Cys és a GSH pool oxidálódott azoknál az egyéneknél, akik cigarettáztak, összehasonlítva azokkal, akik nem dohányoztak (34, 38). Ezek a vizsgálatok együttesen azt mutatják, hogy a kémiai expozíció jelentős változásokat idézhet elő a Cys és a GSH homeosztázisban.

A GSH és a cisztein kölcsönhatásai emberi plazmában. A GSH/GSSG és Cys/CySS poolok kölcsönhatásának meghatározásához 24 egészséges, 25-35 éves egyén plazmájában mértük a tiol és diszulfid formákat (26). Ebben a vizsgálatban a GSH-koncentráció korrelált a Cys-koncentrációval, de nem figyeltek meg korrelációt a GSSG és a CySS, illetve a redukált és oxidált komponensek között. Ezen értékek egyensúlyának hiánya alátámasztja azt az értelmezést, hogy a plazma GSH és Cys redox értékek az oxidatív és antioxidáns folyamatok közötti szisztémás egyensúly dinamikus indikátorai (26).

A Cys-hiány in vitro a GSH/GSSG redox jelentős oxidációját eredményezi. A HT29 vastagbélkarcinóma sejtvonalban a Cys-hiányra és a Cys-kiújulásra vonatkozó vizsgálat során azt találtuk, hogy az alacsony Cys-t és CySS-t tartalmazó tápközegben végzett tenyésztés csökkent GSH-t és GSSG-t eredményezett, amihez a GSH/GSSG redox állapotának 80 mV-os oxidációja társult (29). . Cys vagy CySS hozzáadása után a GSH/GSSG redox hatása 1 óra alatt helyreállt, míg a GSH koncentrációja 8 órán keresztül tovább nőtt (33). Ezeket az eredményeket most megerősítették a Hela sejtekben és a normál humán retina pigment epiteliális sejtekben (nincs ábrázolva), ami azt jelzi, hogy a Cys sejtek számára való elérhetőségének változása általános hatással van a GSH/GSSG redox állapotára.

Az extracelluláris tiol/diszulfid redox állapot oxidációja érzékenyíti a sejteket a vegyi anyagok által kiváltott toxicitásra. Az oxidatív stressz fokozza a halálreceptor komponensek, a Fas és Fas ligand expresszióját (35). Annak meghatározására, hogy a tiol/diszulfid redox állapot változásai befolyásolhatják-e a kémiai toxicitásra való érzékenységet, normál humán retina pigment epiteliális sejteket tenyésztettünk olyan tápközegben, ahol a Cys és CySS koncentrációja szisztematikusan változott, hogy az emberi plazmában in vivo talált redox értékeket kapjunk. t-butil-hidroperoxiddal kezeljük. Az eredmények azt mutatták, hogy a csökkentett redox-állapotban tenyésztett sejtek jobban ellenálltak az oxidánsok által kiváltott apoptózisnak, mint az oxidáltabb redox állapotú sejtek. Bár még nem világos, hogy ez a hatás mennyire általános más sejttípusok és más vegyszerek tekintetében, az eredmények arra utalnak, hogy a redox állapot változása önmagában is fontos meghatározója lehet a toxicitásra való érzékenységnek. A fenti eredményekkel együtt ezek az eredmények erős igazolást adnak annak feltárására, hogy a kémiai expozíció és az étrend közötti kölcsönhatás indukálhat-e kimutatható redox változásokat, és hogy a tiol/diszulfid redox állapot változásának változatos metabolikus következményei kimutathatók-e nagy felbontású metabolikus elemzéssel.

Az emberi vizelet nagy felbontású 1H-NMR-je. A különböző kén-aminosav-bevitel hatására bekövetkező metabolikus változások mérésére alkalmas NMR-spektrumok mérésére műszereink érzékenységének vizsgálatára 2 egymást követő napon gyűjtött vizelet spektrumát 3 g Cys orális kiegészítése nélkül, illetve orális kiegészítéssel kaptuk. A mintákat (300 μl) összekevertük 150 μl 200 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH 7,4) és 50 μl 2H2O-val, mielőtt a spektrumot Varian Inova 600 MHz spektrométerrel rögzítették. Bár az adatok túl előzetesek ahhoz, hogy következtetéseket lehessen levonni, az eredmények azt mutatják, hogy a spektrális minőség hasonló a Nicholson és munkatársai által közölthez (23-25, 36-37), és alkalmas nagyszámú metabolit koncentrációjának változásának kimutatására. Különösen a Nicholson által azonosított csúcsok voltak jelen, és számos különbség volt nyilvánvaló a kiegészítő Cys-t tartalmazó és anélküli minták között.