慢性同種移植腎症の非侵襲的検出のための新しい戦略

我々は、CAN 患者は、末梢血単核球 (PBMC) および尿細胞で検出可能な、遺伝子発現プロファイリングの異なるパターン (非 CAN 対照と比較して) を示すのではないかと仮説を立てています。 末梢血または移植片とその局所環境 (尿サンプル) に存在する差異を研究することで、治療プログラムを改善するための有益なバイオマーカーが発見される可能性があります。

具体的な目的:

目的 1: 腎臓移植レシピエントの CAN を特徴付ける分子機構に関与する遺伝子を調査するために、CAN 患者の腎生検サンプルにおける遺伝子発現を研究します。 比較分析のために、正常な腎生検 (対照グループ 1) における遺伝子発現プロファイリングを研究します。

目的 2: 腎移植レシピエントの免疫学的状態および臨床状態を測定する手段として、末梢血単核球 (PBMC) および尿細胞の遺伝子発現パターンを評価する役割があるかどうかを判断するために、PBMC、尿細胞の遺伝子発現プロファイルを比較します。そして生検サンプル。

AIM 3: CAN の診断における AIMS 1 および 2 から得られる一連のマーカーの臨床的有用性を確立するために、限られたマーカーのパネルを使用して PBMC および尿サンプルに「リアルタイム」(RT)-PCR を使用します。独立した患者グループ。

目的 4: 免疫抑制治療としてミコフェノール酸モフェチル (MMF) を受けている患者における CAN の早期検出における、事前に確立された分子マーカーのパネルの役割を研究するために、移植後 12 か月以上経過した患者の尿および PBMC サンプルを研究します。 、正常なクレアチニンとタンパク尿を伴います。

背景と意義:

慢性同種移植片腎症 (CAN) は、移植片喪失のかなりの部分の原因となる腎移植の重篤な合併症です (1-5)。 現在利用可能な免疫抑制療法は、移植臓器の急性拒絶反応に対してますます有効になってきていますが、慢性拒絶反応（CR）の治療は依然として困難です。 それにもかかわらず、腎移植による CR 患者のかなりの割合が、長期間にわたって満足のいく臓器機能を維持しています。 CAN は腎機能の進行性の低下を特徴としますが、これは特定の原因に起因するものではありません (6-8)。 CAN は、免疫成分と非免疫成分の両方による未定義の病因に起因する、あまり知られていない複雑なプロセスです (8)。 同種抗原依存性の CAN の原因には、急性拒絶反応エピソード、特に多発性、遅発性、または血管性の急性拒絶反応エピソードが含まれます (9-13)。 新しい免疫抑制療法の使用により、急性拒絶反応の頻度が減少し、将来の CAN の発展に影響を与える可能性があります。 しかし、ドナーの抗原非依存性因子も CAN の発生と進行に関与しています。 これには、移植後期の結果に影響を与えるドナーの年齢や不一致の数などのドナー関連の要因が含まれます (13)。 長期間の冷虚血時間などの提供に関連した状況は、移植片機能の遅延と関連しており、後期腎移植の結果不良に関連しています。

レシピエント関連因子は、腎動脈の血管を含む腎臓の機能単位の加速的な劣化とそれに続く腎臓の相対的低酸素状態に寄与する補因子としても作用する可能性があり、間質性線維症を引き起こすことがよくあります。 興味深いことに、慢性損傷および線維症に関与する経路の多くは、これらの変化の下流への影響が病理によってまだ明らかになっていない損傷の過程の非常に早い段階で調節されています。

CAN の組織病理学的特徴は、平滑筋細胞と実質細胞が増殖して腎動脈の狭窄を引き起こす血管壁の増殖性変化によって特徴付けられ、これが組織の相対的な低酸素症の一因となる可能性があります。 その後、線維芽細胞が血管壁の線維性瘢痕化に寄与します。 CAN は、尿細管萎縮とともに間質組織での線維症の発生も特徴とします (14)。 糸球体は、さまざまな程度の糸球体硬化症の影響を受けることもよくあります。 炎症性浸潤は頻繁に見られ、リンパ球および単球マクロファージが腎臓の実質的にすべての影響を受けた区画に浸潤することで構成されます。 CAN で観察される炎症性浸潤は、抗原依存性因子と抗原非依存性因子の両方によって誘発される可能性があります。 これらの組織病理学的変化は、CAN の程度のスコアを与える Banff システム (14) に従って等級付けできます。 これらの組織病理学的変化は協調して作用し、腎同種移植片の機能不全が徐々に進行する原因となります。

固形臓器移植における基礎研究では、臓器拒絶反応につながる免疫学的カスケードにおける個々の遺伝子の特定の機能的役割が特徴付けられています。 それにもかかわらず、急性拒絶反応の結果、慢性拒絶の進行における臨床的ばらつき、および移植片寛容を獲得する可能性によって、免疫系の有意な冗長性が示唆されている。 これらすべての複雑なシステムの根底には、既知および新規の分子経路における複数の遺伝子の一致した発現と共制御があります。 エフェクター応答を適応させる際の個々の機能を確認することは、マイクロアレイを使用した遺伝子発現プロファイリングによって可能になりました。 cDNA マイクロアレイ (顕微鏡スライドまたはシリコン チップ上に固定化された相補的 DNA またはオリゴヌクレオチドによって表される多数の遺伝子) は、がんにおける遺伝子発現のプロファイリングに使用することに成功しましたが (15、16、17、18、19)、移植研究におけるその影響は非常に大きくなっています。これまでは比較的控えめでした。

強調表示されたセクションを削除するか、少なくとも括弧内に置くことをお勧めします。 明確にするための文であることはわかっていますが、文が非常にわかりにくくなってしまいます。

非侵襲的免疫モニタリングが、特に急性拒絶反応の存在の予測に関して、腎移植後の早期に有用である可能性があるという証拠が蓄積されている(20,21)。 慢性同種移植片腎症（CAN）が末梢血細胞または尿細胞の一貫した変化と関連しているかどうかは、あまり明らかではありません。

さらに、同種移植片の機能不全を診断する現在の方法は、臨床症状が確立する前に生じる重大な臓器損傷を検出するには不十分である。 同種移植片の機能不全/拒絶反応の検出、治療に対する反応のモニタリング、長期転帰の予測を可能にするアッセイや新しい技術の開発は、移植の成功にとって不可欠です。

このプロジェクトでは、CAN 患者の腎生検における遺伝子発現プロファイリングを使用して CAN を特徴付ける分子マーカーを確立し、これらの所見を同じ患者の PBMC および尿サンプルのプロファイルと関連付けることを提案します。 さらに、我々は、RT-PCRを使用して、マイクロアレイ解析の結果として得られる限られた分子マーカーセットの臨床的有用性を(独立した患者グループにおいて)確立し、検証する予定である。

V. 統計分析:

データ セキュリティ プラン CAN の有無にかかわらず、腎移植患者の腎臓組織、PBMC、および尿が研究されます。 患者のすべての人口統計情報を含む安全なデータベースはバージニア コモンウェルス大学に保管されますが、患者 ID は削除され、各患者に研究番号が割り当てられます。 必要な組織には、CAN 患者からの腎生検のみが含まれます。

人間の被験者:

A. 説明および研究材料 腎臓組織は、臨床的に CAN が疑われる患者 (少なくとも 15 人の患者) からインフォームドコンセントを得て入手します。 組織サンプル（針生検）は、標本の完全性を維持するために、切除後 5 分以内に液体窒素中で急速冷凍され、ドライアイス上で適切な条件下で出荷されます。 すべてのサンプルは病理学的評価のために提出され、病理学報告書と臨床概要は、患者識別子を削除し、割り当てられた患者番号をラベルに貼り付けることで患者の機密性を保証する方法で、すべてのケースでサンプルとともに送信されます。

生検時に患者から末梢血および尿サンプル (大さじ 1 ～ 2 杯) を採取します。 腎臓生検は、移植時に正常な腎臓からインフォームドコンセントを得て取得されます（ドナー腎臓からの針生検、N=10）。

末梢血および尿サンプルは、生検によってCANと診断された腎移植患者からインフォームドコンセントを得て、1年間にわたって毎月収集されます。 対照群として、クレアチニンレベルが1.6 mg/dL未満、タンパク尿が500 mg/24時間未満の安定した長期移植患者（TX後12か月以上）が研究されます。 (対照群に含める患者の推定数を指定することもできます) ヒト被験者を扱うすべての実践は、バージニア コモンウェルス大学の被験者保護に関する治験審査委員会の倫理ガイドラインに従って実行されます。

募集計画 VCU Hume-Lee 移植クリニックを受診し、包含/除外基準に該当する患者は、この研究に参加するよう求められます。

B. 潜在的なリスク 採血時には、採血部位にあざ、出血、腫れ、感染が生じるリスクがあります。

腎生検では、針が体内に刺さる部分に痛みを感じたり、打撲傷ができたりすることがあります。 針が腎臓に挿入された場所で出血が発生する場合があります。 尿に血が混じることもあります。

機密保持にはあらゆる努力が払われます。 すべての識別情報は安全なデータバンクに保管され、アクセスは研究職員に限定されます。

C. リスクの軽減 組織生検で採取される組織は、診断目的で採取されるサンプルの一部であり、特にこのプロトコルのために採取されるものではありません。 血液サンプルは、静脈アクセスがすでに設置されているのと同時に採取されます。 生検の前に尿サンプルが収集されます。

組織、PBMC、尿サンプルを扱うすべてのスタッフは訓練を受けており、HCV 感染組織を安全に取り扱う資格を持っています。

D. リスク/利益 これは治療研究ではないため、研究対象者に対する特定のリスクはありません。 CANは、研究に参加するかどうかにかかわらず、同様に診断され、治療されます。 患者がこの研究への参加から利益を得られるという保証はありません。 得られた知識は、将来、特に CAN の診断において非常に貴重になる可能性があります。

D. 報酬プラン 被験者には、この研究への参加に対して報酬は支払われません。 E. 同意の問題 研究要件を満たす患者には同意が与えられます。