Nuevas estrategias para la detección no invasiva de la nefropatía crónica del injerto

Presumimos que los pacientes con CAN manifestarán diferentes patrones de perfiles de expresión génica (en comparación con los controles sin CAN), detectables en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células de orina. Al estudiar las diferencias que existen en la sangre periférica o en el injerto y su entorno local (muestras de orina), se pueden descubrir biomarcadores informativos para mejorar los programas de tratamiento.

Objetivos específicos:

OBJETIVO 1: Para investigar los genes implicados en el mecanismo molecular que caracterizan la CAN en receptores de trasplante renal, estudiaremos la expresión génica en muestras de biopsia renal de pacientes con CAN. Para el análisis de comparación, estudiaremos el perfil de expresión génica en biopsias de riñón normales (Grupo de control 1).

OBJETIVO 2: Para determinar si la evaluación de los patrones de expresión génica de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y de células de orina tiene un papel como medio para medir el estado inmunológico y clínico de los receptores de trasplantes de riñón, compararemos los perfiles de expresión génica entre PBMC, y muestras de biopsia.

OBJETIVO 3: Para establecer la utilidad clínica del conjunto de marcadores resultantes de AIMS 1 y 2 en el diagnóstico de CAN, usaremos "tiempo real" (RT)-PCR en PBMC y muestras de orina empleando un panel limitado de marcadores en un grupo independiente de pacientes.

OBJETIVO 4: Estudiar el papel del panel preestablecido de marcadores moleculares en la detección temprana de CAN en pacientes que reciben micofenolato mofetilo (MMF) como tratamiento inmunosupresor, estudiaremos muestras de orina y PBMC de pacientes con más de 12 meses postrasplante , con creatinina normal y proteinuria.

Antecedentes y significado:

La nefropatía crónica del injerto (NAC) es una complicación devastadora del trasplante renal que es responsable de una proporción significativa de la pérdida del injerto (1-5). Aunque la terapia inmunosupresora actualmente disponible es cada vez más eficaz contra el rechazo agudo de un órgano trasplantado, el rechazo crónico (CR) sigue siendo difícil de tratar. No obstante, una proporción relevante de pacientes con RC de un trasplante renal mantienen una función orgánica satisfactoria durante mucho tiempo. La CAN se caracteriza por una disminución progresiva de la función renal, que no es atribuible a una causa específica (6-8). La CAN es un proceso complejo poco conocido que resulta de una etiología aún no definida con componentes tanto inmunes como no inmunes (8). Las causas de NAC dependientes de aloantígenos incluyen episodios de rechazo agudo, particularmente episodios de rechazo agudo múltiple, tardío o vascular (9-13). Con el uso de un nuevo régimen inmunosupresor, la frecuencia de los episodios de rechazo agudo se ha reducido, lo que posiblemente influya en el desarrollo futuro de CAN. Sin embargo, los factores independientes del antígeno del donante también juegan un papel en la aparición y progresión de la CAN. Esto incluye factores relacionados con el donante, como la edad del donante y el número de discrepancias, que tienen un impacto en el resultado tardío del injerto (13). Las circunstancias relacionadas con la donación, como un tiempo prolongado de isquemia fría, se asocian con un retraso en la función del injerto y se relacionan con malos resultados del trasplante renal tardío.

Los factores relacionados con el receptor también pueden actuar como cofactores que contribuyen a un deterioro acelerado de las unidades funcionales en el riñón, incluidas las vasculares, de las arterias renales y una subsiguiente hipoxia relativa del riñón, que con frecuencia conduce a la fibrosis intersticial. Curiosamente, muchas de las vías involucradas en la lesión crónica y la fibrosis se regulan muy temprano en el curso de la lesión, cuando los efectos posteriores de estas alteraciones aún no son evidentes por la patología.

Las características histopatológicas de la NAC pueden caracterizarse por cambios proliferativos de la pared vascular, en los que proliferan las células del músculo liso y las células parenquimatosas, lo que conduce a un estrechamiento de las arterias renales, lo que puede contribuir a una hipoxia relativa del tejido. Posteriormente, los fibroblastos contribuirán a la cicatrización fibrótica en la pared vascular. La CAN también se caracteriza por la aparición de fibrosis en el tejido intersticial junto con atrofia tubular (14). Los glomérulos también suelen verse afectados por diversos grados de glomeruloesclerosis. Con frecuencia se encuentra un infiltrado inflamatorio que consiste en la invasión de linfocitos y monocitos-macrófagos en prácticamente todos los compartimentos afectados del riñón. El infiltrado inflamatorio observado en la CAN puede ser inducido tanto por factores dependientes de antígeno como independientes de antígeno. Estos cambios histopatológicos se pueden clasificar según el sistema de Banff (14), que da una puntuación del grado de CAN. Estos cambios histopatológicos actúan en concierto, contribuyendo a una progresión gradual de la disfunción del aloinjerto renal.

Los estudios fundamentales en el trasplante de órganos sólidos han caracterizado roles funcionales específicos para genes individuales en la cascada inmunológica que conduce al rechazo de órganos. No obstante, la variabilidad clínica en los resultados del rechazo agudo, en la progresión del rechazo crónico y en la posibilidad de adquirir tolerancia al injerto sugiere una redundancia significativa en el sistema inmunitario. Detrás de todos estos sistemas complejos se encuentran la expresión concordante y la co-regulación de múltiples genes en rutas moleculares conocidas y novedosas. Determinar sus funciones individuales en la adaptación de la respuesta del efector ahora es posible con el perfil de expresión génica usando micromatrices. Aunque las micromatrices de ADNc (una gran cantidad de genes representados por ADN complementario u oligonucleótidos inmovilizados en portaobjetos de microscopio o chips de silicio) se utilizaron con éxito para perfilar la expresión génica en el cáncer (15,16,17,18,19), su impacto en la investigación de trasplantes ha sido tan ha sido hasta ahora relativamente modesto.

Sugiero que se elimine la sección resaltada, o al menos se coloque entre paréntesis. Hace que la oración sea muy difícil de entender, aunque sé que tiene la intención de aclarar.

Cada vez hay más pruebas de que la monitorización inmunitaria no invasiva puede ser útil en el período inicial tras el trasplante renal (20,21), en particular con respecto a la predicción de la presencia de rechazo agudo. Está menos claro si la nefropatía crónica del injerto (CAN, por sus siglas en inglés) también se asocia con cambios constantes en las células de la orina o la sangre periférica.

Además, los métodos actuales para diagnosticar la disfunción del aloinjerto son inadecuados para detectar el daño orgánico significativo que ocurre antes del establecimiento de las manifestaciones clínicas. El desarrollo de ensayos o tecnologías novedosas que permitan la detección de la disfunción/rechazo del aloinjerto, controlen las respuestas a la terapia y predigan los resultados a largo plazo es vital para el éxito del trasplante.

En este proyecto nos proponemos establecer los marcadores moleculares que caracterizan CAN utilizando perfiles de expresión génica en biopsias renales de pacientes con CAN y relacionar estos hallazgos con los perfiles en PBMC y muestras de orina de los mismos pacientes. Además, estableceremos y validaremos (en un grupo independiente de pacientes) la utilidad clínica de un conjunto limitado de marcadores moleculares, resultantes del análisis de microarrays, mediante RT-PCR.

V. Análisis Estadístico:

Plan de seguridad de datos Se estudiará tejido renal, PBMC y orina de pacientes con trasplante de riñón con o sin CAN. Se mantendrá una base de datos segura que contiene toda la información demográfica de los pacientes en la Virginia Commonwealth University, pero se eliminarán los identificadores de los pacientes y se asignará un número de estudio a cada paciente. Los tejidos requeridos incluirán biopsias renales solo de pacientes con CAN.

Sujetos humanos:

A. Descripción y materiales de investigación Se obtendrán tejidos renales con consentimiento informado de pacientes con sospecha clínica de NAC (al menos 15 pacientes). Las muestras de tejido (biopsias con aguja) se congelarán instantáneamente en nitrógeno líquido dentro de los 5 minutos posteriores a la escisión y se enviarán en condiciones apropiadas, en hielo seco, para mantener la integridad de la muestra. Todas las muestras se enviarán para evaluación patológica y se enviará un informe patológico y un resumen clínico con las muestras en todos los casos de manera que se garantice la confidencialidad del paciente eliminando los identificadores del paciente y rotulándolos con el número de paciente asignado.

Se obtendrán muestras de sangre periférica y orina (1-2 cucharadas) de los pacientes en el momento de la biopsia. Se obtendrán biopsias de riñón con consentimiento informado de riñones normales en el momento del trasplante (biopsia con aguja de riñón de donante, N=10).

Se recolectarán muestras de sangre periférica y orina mensualmente durante 1 año con consentimiento informado de pacientes trasplantados renales con diagnóstico de CAN confirmado por biopsia. Como Grupo Control se estudiarán pacientes trasplantados estables a largo plazo (más de 12 meses post-TX) con niveles de creatinina < 1,6 mg/dL y proteinuria inferior a 500 mg/24hs. (Es posible que desee dar un número estimado de pacientes que se incluirán en el grupo de control) Todas las prácticas relacionadas con seres humanos se realizarán de acuerdo con las pautas éticas de la Junta de Revisión Institucional para la Protección de Sujetos Humanos de la Virginia Commonwealth University.

Plan de reclutamiento A los pacientes atendidos en la Clínica de Trasplantes Hume-Lee de VCU que califiquen de acuerdo con los criterios de inclusión/exclusión se les pedirá que participen en este estudio.

B. Riesgos potenciales Cuando se extrae sangre, existe el riesgo de hematomas, sangrado, hinchazón o infección en el sitio donde se extrae la sangre.

Las biopsias de riñón pueden ser dolorosas donde la aguja ingresa al cuerpo y se puede formar un hematoma. El sangrado puede ocurrir donde se inserta la aguja en el riñón. Puede aparecer sangre en la orina.

Se hará todo lo posible para mantener la confidencialidad. Toda la información de identificación se mantendrá en un banco de datos seguro con acceso limitado al personal de investigación.

C. Reducción de riesgos El tejido que se obtiene mediante la biopsia de tejido forma parte de la muestra que se obtendría con fines de diagnóstico y no específicamente para este protocolo. Las muestras de sangre se obtendrán al mismo tiempo que ya está colocado el acceso venoso. Se recolectará una muestra de orina antes de la biopsia.

Todos los miembros del personal que manipulan muestras de tejido, PBMC y orina han sido capacitados y están calificados para manipular con seguridad tejido infectado con VHC.

D. Riesgo/beneficio Debido a que este no es un estudio de tratamiento, no existen riesgos específicos para los sujetos del estudio. La CAN será diagnosticada y tratada de la misma manera, participe o no en el estudio. No hay garantía de que los pacientes se beneficien de la participación en este estudio. El conocimiento adquirido puede ser invaluable en el futuro, particularmente para el diagnóstico de CAN.

D. Plan de Compensación Los Sujetos no serán compensados ​​por su participación en este estudio. E. Problemas de consentimiento Se dará consentimiento a los pacientes que cumplan con los requisitos del estudio.