Uudet strategiat kroonisen allograftin nefropatian ei-invasiiviseen havaitsemiseen

Oletamme, että CAN-potilailla ilmenee erilaisia ​​​​geenin ilmentymisen profilointimalleja (verrattuna ei-CAN-kontrolleihin), jotka voidaan havaita perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC) ja virtsan soluissa. Tutkimalla eroja, joita on perifeerisessä veressä tai siirressä ja sen paikallisessa ympäristössä (virtsanäytteet), voidaan löytää informatiivisia biomarkkereita hoito-ohjelmien parantamiseksi.

Erityiset tavoitteet:

TAVOITE 1: Tutkiaksemme geenejä, jotka osallistuvat molekyylimekanismiin, joka luonnehtii CAN:ia munuaissiirteen saajilla, tutkimme geenin ilmentymistä munuaisbiopsianäytteissä CAN-potilailta. Vertailuanalyysiä varten tutkimme geeniekspression profilointia normaaleissa munuaisbiopsioissa (vertailuryhmä 1).

TAVOITE 2: Sen määrittämiseksi, onko perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) ja virtsan solujen geeniekspressiomallien arvioinnissa merkitystä keinona mitata munuaissiirteen saajien immunologista ja kliinistä tilaa, vertaamme geeniekspressioprofiileja PBMC:n ja virtsan välillä. ja biopsianäytteet.

TAVOITE 3: Tavoitteista 1 ja 2 saatujen markkerien kliinisen hyödyn määrittämiseksi CAN:n diagnosoinnissa käytämme "reaaliaikaista" (RT)-PCR:ää PBMC:ssä ja virtsanäytteissä, joissa käytetään rajoitettua markkeripaneelia. riippumaton potilasryhmä.

TAVOITE 4: Tutkiaksemme ennalta laaditun molekyylimarkkeripaneelin roolia CAN:n varhaisessa havaitsemisessa potilailla, jotka saavat mykofenolaattimofetiilia (MMF) immunosuppressiivisena hoitona, tutkimme virtsa- ja PBMC-näytteitä potilailta yli 12 kuukautta transplantaation jälkeen. , normaali kreatiniini ja proteinuria.

Tausta ja merkitys:

Krooninen allograft-nefropatia (CAN) on tuhoisa munuaisensiirron komplikaatio, joka aiheuttaa merkittävän osan siirteen menetyksestä (1–5). Vaikka tällä hetkellä saatavilla oleva immunosuppressiohoito on yhä tehokkaampi siirretyn elimen akuuttia hylkimisreaktiota vastaan, kroonista hylkimistä (CR) on edelleen vaikea hoitaa. Siitä huolimatta merkittävä osa munuaissiirteen CR-potilaista ylläpitää tyydyttävää elinten toimintaa pitkään. CAN:lle on ominaista progressiivinen munuaisten toiminnan heikkeneminen, joka ei johdu tietystä syystä (6-8). CAN on huonosti tunnettu monimutkainen prosessi, joka johtuu toistaiseksi määrittelemättömästä etiologiasta, jossa on sekä immuuni- että ei-immuunikomponentteja (8). CAN:n alloantigeeniriippuvaisia ​​syitä ovat akuutit hyljintäjaksot, erityisesti useat, myöhäiset tai verisuonten akuutit hyljintäjaksot (9-13). Uuden immunosuppressiivisen hoito-ohjelman käytön myötä akuuttien hylkimisjaksojen esiintymistiheys on vähentynyt, mikä voi mahdollisesti vaikuttaa CAN:n tulevaan kehitykseen. Luovuttajaantigeenista riippumattomilla tekijöillä on kuitenkin myös rooli CAN:n esiintymisessä ja etenemisessä. Tämä sisältää luovuttajiin liittyvät tekijät, kuten luovuttajan ikä ja epäsuhtautumisten lukumäärä, jotka vaikuttavat myöhäiseen siirteen lopputulokseen (13). Luovutukseen liittyvät olosuhteet, kuten pitkittynyt kylmäiskemia, liittyvät siirteen toiminnan viivästymiseen ja huonoihin myöhäisiin munuaisensiirtotuloksiin.

Vastaanottajaan liittyvät tekijät voivat myös toimia yhteistekijöinä, jotka myötävaikuttavat munuaisvaltimoiden toiminnallisten yksiköiden, mukaan lukien verisuonten, nopeutuneeseen heikkenemiseen ja sitä seuraavaan munuaisen suhteelliseen hypoksiaan, mikä usein johtaa interstitiaaliseen fibroosiin. Mielenkiintoista on, että monia krooniseen vaurioon ja fibroosiin liittyvistä reiteistä säädellään hyvin varhaisessa vamman kulussa, kun näiden muutosten myötävirtavaikutukset eivät vieläkään ole ilmeisiä patologian vuoksi.

CAN:n histopatologisia piirteitä voidaan luonnehtia verisuonen seinämän proliferatiivisilla muutoksilla, joissa sileät lihassolut ja parenkymaaliset solut lisääntyvät, mikä johtaa munuaisvaltimoiden kaventumiseen, mikä voi myötävaikuttaa kudoksen suhteelliseen hypoksiaan. Myöhemmin fibroblastit myötävaikuttavat fibroottiseen arpeutumiseen verisuonen seinämässä. CAN:lle on myös tunnusomaista fibroosin esiintyminen interstitiaalisessa kudoksessa sekä tubulusatrofia (14). Munakeräsissä esiintyy usein myös eriasteista glomeruloskleroosia. Tulehduksellinen infiltraatti löytyy usein, ja se koostuu tunkeutuvista lymfosyyteistä ja monosyyteistä-makrofageista käytännöllisesti katsoen kaikkiin munuaisen sairaisiin osiin. CAN:ssa havaittu tulehduksellinen infiltraatti voidaan indusoida sekä antigeeniriippuvaisilla että antigeenista riippumattomilla tekijöillä. Nämä histopatologiset muutokset voidaan luokitella Banff-järjestelmän mukaisesti (14), joka antaa pisteytyksen CAN-asteesta. Nämä histopatologiset muutokset toimivat yhdessä ja edistävät munuaissiirteen toimintahäiriön asteittaista etenemistä.

Kiinteiden elinsiirtojen perustutkimukset ovat luonnehtineet yksittäisten geenien erityisiä toiminnallisia rooleja immunologisessa kaskadissa, joka johtaa elimen hylkimiseen. Siitä huolimatta, että immuunijärjestelmässä on merkittävää redundanssia, viittaa kliininen vaihtelu akuuttien hylkimisreaktioiden tuloksiin, kroonisen hyljintäreaktion eteneminen ja mahdollisuus saada siirteen sietokyky. Kaikkien näiden monimutkaisten järjestelmien taustalla on useiden geenien samanaikainen ilmentyminen ja yhteissäätely tunnetuilla ja uusilla molekyylireiteillä. Niiden yksittäisten toimintojen varmistaminen efektorivasteen mukauttamisessa on nyt mahdollista geeniekspressioprofiloinnilla mikrosirujen avulla. Vaikka cDNA-mikrosiruja (suuri määrä geenejä, joita edustavat komplementaariset DNA:t tai oligonukleotidit, jotka on immobilisoitu mikroskoopin objektilaseille tai piisiruille) käytettiin menestyksekkäästi profiloimaan geenien ilmentymistä syövässä (15, 16, 17, 18, 19), niiden vaikutus elinsiirtotutkimukseen on toistaiseksi ollut suhteellisen vaatimatonta.

Ehdotan, että korostettu osio poistetaan tai ainakin sijoitetaan sulkeisiin. Se tekee lauseesta erittäin vaikea ymmärtää, vaikka tiedän, että sen on tarkoitus selventää.

On kasautunut näyttöä siitä, että ei-invasiivinen immuunijärjestelmän seuranta voi olla hyödyllistä varhaisessa vaiheessa munuaisensiirron jälkeen (20, 21), erityisesti mitä tulee akuutin hylkimisreaktion ennustamiseen. On vähemmän selvää, liittyykö krooninen allograft-nefropatia (CAN) myös johdonmukaisiin muutoksiin ääreisveren tai virtsan soluissa.

Lisäksi nykyiset menetelmät allograftin toimintahäiriön diagnosoimiseksi eivät ole riittäviä havaitsemaan merkittäviä elinvaurioita, joita esiintyy ennen kliinisten ilmentymien toteamista. Sellaisten määritysten tai uusien teknologioiden kehittäminen, jotka mahdollistavat allograftin toimintahäiriön/hyljintäreaktion havaitsemisen, hoitovasteiden tarkkailun ja pitkän aikavälin tulosten ennustamisen, on elintärkeää transplantaation onnistumisen kannalta.

Tässä projektissa ehdotamme CAN:ia karakterisoivien molekyylimarkkerien määrittämistä käyttämällä geeniekspressioprofiilia CAN-potilaiden munuaisbiopsioissa ja yhdistämään nämä löydökset PBMC-profiileihin ja samojen potilaiden virtsanäytteisiin. Lisäksi määritämme ja validoimme (riippumattomassa potilasryhmässä) mikrosiruanalyysin tuloksena saatavan rajoitetun molekyylimarkkerijoukon kliinisen käyttökelpoisuuden RT-PCR:n avulla.

V. Tilastollinen analyysi:

Tietoturvasuunnitelma Tutkitaan munuaiskudosta, PBMC:tä ja virtsaa munuaisensiirtopotilailta, joilla on tai ei ole CAN:ia. Virginia Commonwealth -yliopistossa säilytetään suojattua tietokantaa, joka sisältää kaikki potilaiden demografiset tiedot, mutta potilastunnisteet poistetaan ja jokaiselle potilaalle annetaan tutkimusnumero. Tarvittavat kudokset sisältävät vain munuaisbiopsiat potilailta, joilla on CAN.

Ihmisaiheet:

A. Kuvaus ja tutkimusmateriaalit Munuaiskudokset hankitaan tietoon perustuvalla suostumuksella potilailta, joilla on kliininen CAN-epäily (vähintään 15 potilasta). Kudosnäytteet (neulabiopsiat) jäädytetään nestemäisessä typessä 5 minuutin kuluessa leikkauksesta ja kuljetetaan asianmukaisissa olosuhteissa kuivajäässä näytteen eheyden säilyttämiseksi. Kaikki näytteet toimitetaan patologiseen arviointiin ja näytteiden mukana lähetetään kaikissa tapauksissa patologinen raportti ja kliininen yhteenveto potilaan luottamuksellisuuden varmistamiseksi poistamalla potilastunnisteet ja merkinnät annetulla potilasnumerolla.

Perifeeriset veri- ja virtsanäytteet (1-2 rkl) otetaan potilailta biopsian yhteydessä. Munuaisbiopsiat otetaan tietoisella suostumuksella normaaleista munuaisista siirron yhteydessä (neulabiopsia luovuttajan munuaisesta, N = 10).

Perifeeriset veri- ja virtsanäytteet kerätään kuukausittain 1 vuoden ajan tietoisella suostumuksella munuaisensiirtopotilailta, joilla on biopsialla vahvistettu CAN-diagnoosi. Kontrolliryhmänä tutkitaan stabiileja pitkäaikaisia ​​elinsiirtopotilaita (yli 12 kuukautta TX:n jälkeen), joiden kreatiniinitaso on <1,6 mg/dl ja proteinuria alle 500 mg/24 tuntia. (Voit haluta ilmoittaa arvioitujen potilaiden lukumäärän, jotka sisällytetään valvontaryhmään.) Kaikki ihmisaiheita koskevat käytännöt suoritetaan Virginia Commonwealth -yliopiston Institutional Review Board for the Protection of Human Subjects eettisten ohjeiden mukaisesti.

Rekrytointisuunnitelma VCU Hume-Lee Transplant Clinicillä havaitut potilaat, jotka täyttävät mukaanotto-/poissulkemiskriteerit, pyydetään osallistumaan tähän tutkimukseen.

B. Mahdolliset riskit Verenottokohdassa on mustelmien, verenvuodon, turvotuksen tai infektion vaara.

Munuaisbiopsiat voivat olla tuskallisia, jos neula joutuu kehoon, ja mustelma voi muodostua. Verenvuotoa voi esiintyä, kun neula työnnetään munuaiseen. Virtsassa voi esiintyä verta.

Luottamuksellisuuden säilyttämiseksi tehdään kaikkensa. Kaikki tunnistetiedot säilytetään suojatussa tietopankissa, johon pääsy on rajoitettu tutkimushenkilöstölle.

C. Riskin vähentäminen Kudosbiopsialla saatu kudos on osa näytettä, joka otettaisiin diagnostisia tarkoituksia varten, ei erityisesti tätä protokollaa varten. Verinäytteet otetaan samaan aikaan, kun laskimopääsy on jo paikallaan. Virtsanäyte otetaan ennen biopsiaa.

Kaikki kudos-, PBMC- ja virtsanäytteitä käsittelevät henkilöstön jäsenet on koulutettu ja heillä on pätevyys käsitellä HCV-tartunnan saaneita kudoksia turvallisesti.

D. Riski/hyöty Koska tämä ei ole hoitotutkimus, tutkimushenkilöille ei ole erityisiä riskejä. CAN diagnosoidaan ja hoidetaan samalla tavalla riippumatta siitä, osallistuvatko he tutkimukseen vai eivät. Ei ole takeita siitä, että potilaat hyötyvät osallistumisesta tähän tutkimukseen. Saadut tiedot voivat olla korvaamattomia tulevaisuudessa erityisesti CAN:n diagnosoinnissa.

D. Palkitsemissuunnitelma Koehenkilöille ei makseta korvausta heidän osallistumisestaan ​​tähän tutkimukseen. E. Suostumusongelmat Potilaat, jotka täyttävät tutkimusvaatimukset, saavat suostumuksen.