Nuove strategie per il rilevamento non invasivo della nefropatia cronica da allotrapianto

Ipotizziamo che i pazienti con CAN manifesteranno diversi modelli di profilo di espressione genica (rispetto ai controlli non CAN), rilevabili nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e nelle cellule delle urine. Studiando le differenze che esistono nel sangue periferico o nel trapianto e nel suo ambiente locale (campioni di urina), è possibile scoprire biomarcatori informativi per migliorare i programmi di trattamento.

Obiettivi specifici:

OBIETTIVO 1: Per indagare i geni coinvolti nel meccanismo molecolare che caratterizza la CAN nei trapiantati di rene, studieremo l'espressione genica in campioni di biopsia renale da pazienti con CAN. Per analisi di confronto, studieremo il profilo di espressione genica in biopsie renali normali (Gruppo di controllo 1).

OBIETTIVO 2: Per determinare se esiste un ruolo per valutare i modelli di espressione genica delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e delle cellule urinarie come mezzo per misurare lo stato immunologico e clinico dei riceventi di trapianto di rene, confronteremo i profili di espressione genica tra PBMC, urina e campioni bioptici.

OBIETTIVO 3: Per stabilire l'utilità clinica del set di marcatori risultante da AIMS 1 e 2 nella diagnostica della CAN, utilizzeremo la PCR "tempo reale" (RT) in PBMC e campioni di urina impiegando un pannello limitato di marcatori in un gruppo indipendente di pazienti.

OBIETTIVO 4: Per studiare il ruolo del pannello prestabilito di marcatori molecolari nella diagnosi precoce della CAN in pazienti che ricevono micofenolato mofetile (MMF) come trattamento immunosoppressivo, studieremo campioni di urina e PBMC da pazienti più di 12 mesi dopo il trapianto , con creatinina normale e proteinuria.

Contesto e significato:

La nefropatia cronica da allotrapianto (CAN) è una devastante complicanza del trapianto di rene responsabile di una percentuale significativa di perdita del trapianto (1-5). Sebbene la terapia immunosoppressiva attualmente disponibile sia sempre più efficace contro il rigetto acuto di un organo trapiantato, il rigetto cronico (CR) rimane difficile da trattare. Tuttavia, una percentuale rilevante di pazienti con CR di un trapianto di rene mantiene una funzione d'organo soddisfacente per lungo tempo. La CAN è caratterizzata da un progressivo declino della funzionalità renale, non attribuibile a una causa specifica (6-8). La CAN è un processo complesso poco conosciuto derivante da un'eziologia non ancora definita con componenti sia immunitarie che non immunitarie (8). Le cause alloantigene-dipendenti di CAN includono episodi di rigetto acuto, in particolare episodi di rigetto acuto multipli, tardivi o vascolari (9-13). Con l'uso di un nuovo regime immunosoppressivo, la frequenza degli episodi di rigetto acuto si è ridotta, il che potrebbe avere un'influenza sullo sviluppo futuro della CAN. Tuttavia, anche i fattori indipendenti dall'antigene del donatore svolgono un ruolo nell'insorgenza e nella progressione della CAN. Ciò include fattori correlati al donatore come l'età del donatore e il numero di mismatch, che hanno un impatto sull'esito tardivo del trapianto (13). Circostanze legate alla donazione, come il prolungato tempo di ischemia fredda, sono associate a una funzione ritardata dell'innesto e correlate a scarsi risultati tardivi del trapianto renale.

I fattori correlati al ricevente possono anche agire come co-fattori contribuendo ad un deterioramento accelerato delle unità funzionali nel rene, comprese quelle vascolari, delle arterie renali e una successiva ipossia relativa del rene, che spesso porta alla fibrosi interstiziale. È interessante notare che molti dei percorsi coinvolti nella lesione cronica e nella fibrosi sono regolati molto presto nel corso della lesione, quando gli effetti a valle di queste alterazioni non sono ancora evidenti dalla patologia.

Le caratteristiche istopatologiche della CAN possono essere caratterizzate da alterazioni proliferative della parete vascolare, in cui proliferano le cellule muscolari lisce e le cellule parenchimali, portando a un restringimento delle arterie renali, che può contribuire a una relativa ipossia del tessuto. Successivamente, i fibroblasti contribuiranno alla cicatrizzazione fibrotica nella parete vascolare. La CAN è anche caratterizzata dalla presenza di fibrosi nel tessuto interstiziale insieme all'atrofia tubulare (14). I glomeruli sono anche spesso colpiti da vari gradi di glomerulosclerosi. Si riscontra frequentemente un infiltrato infiammatorio che consiste nell'invasione di linfociti e monociti-macrofagi praticamente in tutti i compartimenti colpiti del rene. L'infiltrato infiammatorio osservato nella CAN può essere indotto sia da fattori antigene-dipendenti che da fattori antigene-indipendenti. Questi cambiamenti istopatologici possono essere classificati secondo il sistema di Banff (14), che fornisce un punteggio del grado di CAN. Questi cambiamenti istopatologici agiscono di concerto, contribuendo a una graduale progressione della disfunzione del trapianto renale.

Studi fondamentali nel trapianto di organi solidi hanno caratterizzato ruoli funzionali specifici per i singoli geni nella cascata immunologica che porta al rigetto dell'organo. Tuttavia, una significativa ridondanza nel sistema immunitario è suggerita dalla variabilità clinica negli esiti di rigetto acuto, nella progressione del rigetto cronico e dalla possibilità di acquisire tolleranza al trapianto. Alla base di tutti questi sistemi complessi ci sono l'espressione concordante e la co-regolazione di più geni in percorsi molecolari noti e nuovi. L'accertamento delle loro funzioni individuali nell'adattamento della risposta effettrice è ora possibile con la profilazione dell'espressione genica mediante microarray. Sebbene i microarray di cDNA (un gran numero di geni rappresentati da DNA complementari o oligonucleotidi immobilizzati su vetrini da microscopio o chip di silicio) siano stati usati con successo per profilare l'espressione genica nel cancro (15,16,17,18,19), il loro impatto nella ricerca sui trapianti ha così finora relativamente modesto.

Suggerisco di cancellare la sezione evidenziata, o almeno di metterla tra parentesi. Rende la frase molto difficile da capire, anche se so che ha lo scopo di chiarire.

Vi sono prove crescenti che il monitoraggio immunitario non invasivo può essere utile nel primo periodo dopo il trapianto renale (20,21), in particolare per quanto riguarda la previsione della presenza di rigetto acuto. È meno chiaro se la nefropatia cronica da allotrapianto (CAN) sia anche associata a cambiamenti consistenti nel sangue periferico o nelle cellule urinarie.

Inoltre, gli attuali metodi di diagnosi della disfunzione dell'allotrapianto sono inadeguati per rilevare il significativo danno d'organo che si verifica prima dell'instaurarsi delle manifestazioni cliniche. Lo sviluppo di test o nuove tecnologie che consentiranno di rilevare la disfunzione/rigetto dell'allotrapianto, monitorare le risposte alla terapia e prevedere gli esiti a lungo termine è vitale per il successo del trapianto.

In questo progetto ci proponiamo di stabilire i marcatori molecolari che caratterizzano la CAN utilizzando il profilo di espressione genica nelle biopsie renali di pazienti con CAN e di mettere in relazione questi risultati con i profili nelle PBMC e nei campioni di urina degli stessi pazienti. Inoltre, stabiliremo e convalideremo (in un gruppo indipendente di pazienti) l'utilità clinica di un insieme limitato di marcatori molecolari, risultanti dall'analisi di microarray, mediante RT-PCR.

V. Analisi statistica:

Piano di sicurezza dei dati Saranno studiati tessuto renale, PBMC e urina di pazienti sottoposti a trapianto di rene con o senza CAN. Un database sicuro contenente tutte le informazioni demografiche per i pazienti sarà conservato presso la Virginia Commonwealth University, ma gli identificatori dei pazienti verranno rimossi e un numero di studio assegnato a ciascun paziente. I tessuti richiesti includeranno biopsie renali solo da pazienti con CAN.

soggetti umani:

A. Descrizione e materiali di ricerca I tessuti renali saranno ottenuti con consenso informato da pazienti con sospetto clinico di CAN (almeno 15 pazienti). I campioni di tessuto (biopsie con ago) saranno congelati in azoto liquido entro 5 minuti dall'escissione e spediti in condizioni appropriate, su ghiaccio secco, per mantenere l'integrità del campione. Tutti i campioni saranno inviati per la valutazione patologica e un rapporto patologico e un riepilogo clinico saranno inviati con i campioni in tutti i casi in modo da assicurare la riservatezza del paziente rimuovendo gli identificatori del paziente e l'etichettatura con il numero del paziente assegnato.

I campioni di sangue periferico e di urina (1-2 cucchiai) saranno prelevati dai pazienti al momento della biopsia. Le biopsie renali saranno ottenute con consenso informato da reni normali al trapianto (agobiopsia da rene donatore, N=10).

I campioni di sangue periferico e di urina saranno raccolti mensilmente durante 1 anno con consenso informato da pazienti sottoposti a trapianto di rene con diagnosi di CAN confermata da biopsia. Come gruppo di controllo, saranno studiati pazienti trapiantati stabili a lungo termine (più di 12 mesi post-TX) con livelli di creatinina <1,6 mg/dL e proteinuria inferiore a 500 mg/24 ore. (Potresti voler fornire un numero stimato di pazienti da includere nel gruppo di controllo) Tutte le pratiche relative a soggetti umani saranno eseguite secondo le linee guida etiche dell'Institutional Review Board for the Protection of Human Subjects della Virginia Commonwealth University.

Piano di reclutamento Ai pazienti visitati presso la VCU Hume-Lee Transplant Clinic che si qualificano secondo i criteri di inclusione/esclusione verrà chiesto di partecipare a questo studio.

B. Rischi potenziali Quando viene prelevato il sangue, esiste il rischio di lividi, sanguinamento, gonfiore o infezione nel punto in cui viene prelevato il sangue.

Le biopsie renali possono essere dolorose nel punto in cui l'ago entra nel corpo e può formarsi un livido. Il sanguinamento può verificarsi nel punto in cui l'ago viene inserito nel rene. Il sangue può apparire nelle urine.

Sarà fatto ogni sforzo per mantenere la riservatezza. Tutte le informazioni identificative saranno conservate in una banca dati sicura con accesso limitato al personale di ricerca.

C. Riduzione del rischio Il tessuto ottenuto dalla biopsia tissutale fa parte del campione che verrebbe ottenuto per scopi diagnostici e non specificamente per questo protocollo. I campioni di sangue saranno prelevati nello stesso momento in cui l'accesso venoso è già in atto. Un campione di urina verrà raccolto prima della biopsia.

Tutti i membri del personale che maneggiano campioni di tessuto, PBMC e urine sono stati addestrati e sono qualificati per maneggiare in sicurezza tessuti infetti da HCV.

D. Rischi/benefici Poiché questo non è uno studio di trattamento, non ci sono rischi specifici per i soggetti dello studio. I CAN verranno diagnosticati e trattati allo stesso modo, indipendentemente dal fatto che partecipino o meno allo studio. Non vi è alcuna garanzia che i pazienti trarranno beneficio dalla partecipazione a questo studio. Le conoscenze acquisite potrebbero essere preziose in futuro, in particolare per la diagnosi di CAN.

D. Piano di compensazione I soggetti non riceveranno alcun compenso per la loro partecipazione a questo studio. E. Problemi relativi al consenso I pazienti che soddisfano i requisiti dello studio riceveranno il consenso.