IL-1遺伝子クラスターにおける多型の役割

目的:

主な目的: Il-1 遺伝子クラスターの多型がアジア人集団の緑内障を予防するかどうかを調査すること。

副次的な目的: 正常血圧緑内障患者と高圧緑内障患者の Il-1 遺伝子クラスターの一塩基多型に違いがあるかどうかを判断すること。

バックグラウンド

緑内障は、視神経の軸索の進行性の喪失を特徴とする不均一な視神経症のグループです。 失明に関する WHO グローバル データバンクに基づくと、緑内障は、世界で推定 3,800 万人の失明者のうち 510 万人を占めています.1 緑内障 世界中で約 7,000 万人が罹患しており、不可逆的な失明の主な原因となっています 2。 世界の高齢者数が急速に増加するにつれて、緑内障の罹患率が上昇し、医療費と経済的負担が増加します。 これは、一度確立された視覚障害を元に戻すことができない状態に対して、公衆衛生上の重要な意味を持ちます。 緑内障の主な危険因子は、房水流出の減少による眼圧の上昇です。

以前の研究では、緑内障がシンガポールにおける視力障害の主な原因であることが示されています3-5。 タンジョンパガー地区の華僑シンガポール人を対象に実施された人口ベースの調査では、緑内障の年齢標準化有病率は、40 歳以上の人口で 3.2% (95% 信頼区間、2.3-4.1) であることがわかりました.3

緑内障には主要な遺伝的基盤があり、緑内障の全症例の 3 分の 1 (範囲 20 ～ 60%) を占めると推定されています 6-8 が、最近の報告ではこれは過小評価であることが示唆されています.9 遺伝的不均一性は、現在までに同定された 15 を超える遺伝子座と 7 つの緑内障を引き起こす遺伝子によって示され、そのうち 10 には POAG で同定された 2 つの遺伝子が含まれています.11-12 開放隅角および発達緑内障を誘発する多様な遺伝的メカニズムが発見されており、これらには、特に転写因子におけるコード変異、13 遺伝子量の変化 14 およびドミナント ネガティブ効果が含まれます。

インターロイキン-1 は、炎症の重要なメディエーターです。 Il-1 アルファと Il-1 ベータの 2 つの炎症誘発性サイトカインがあります。 両方とも、単球、マクロファージ、および上皮細胞によって、組織損傷に対する宿主応答として産生されます。 Il-1 をコードする遺伝子は、染色体 2q14.216 上の 430kb 領域内に位置しています。 Il-1 遺伝子クラスターの多型は、タンパク質の発現を変化させることが示されています。 一塩基多型は、他の病状の中でも特に子癇前症などの他の疾患に関連しています17。

_小柱網細胞における内皮白血球接着分子-1 (ELAM-1) の発現は、緑内障の診断マーカーであることが確認されています18。 _ELAM-1 の発現は、転写因子 NF-Kappa -Beta によって制御される Il-1 自己分泌フィードバック ループの活性化によって制御されます。 緑内障細胞によって内因的に産生される Il-1 は、酸化ストレスに対するアポトーシス応答を阻害することが示されています 18。 Il-1 はまた、マトリックス メタロプロテイナーゼ酵素の発現を刺激することによって流出機能を増加させることも報告されており、これにより細胞外抵抗が減少します 19-22。 毛様体筋緊張の緩和を引き起こす一酸化窒素の合成に対する Il-1 の効果は、房水流出の増加にも寄与している可能性があります 23。

最近、Wang らは、Il-1 バリアントが Il-1 の分泌を増加させ、原発性開放隅角緑内障 (POAG) のリスクを低下させることを示しました 24。 これは、米国フロリダ州で最近開催された 2005 年の ARVO 会議で、「緑内障の新しい考え」の下で発表されました。 バスコム パーマー眼科研究所 (マイアミ) のエリザベス フィニ博士が率いるグループは、POAG に対する保護因子である Il-1 β の遺伝子変異体 (+3953T) を特定しました。 彼らは、100 人の POAG 患者と白人集団の 104 人の正常対照からのゲノム DNA を 40 年以上にわたって評価しました。 Il-1 ベータ (+3953T) の対立遺伝子頻度は、POAG グループよりも正常なコントロールで有意に高かった (28% 対 17%、p=0.01)。 彼らはまた、Il-1 a​​lpha (-889T) の対立遺伝子頻度が、POAG グループよりも正常なコントロールの方が、ボーダーラインの有意性で高いことも発見しました (39% 対 29%、p=0.06)。 これは、より大きなサンプルサイズで有意であることが証明される場合があります。

このプロジェクトでは、白​​人に見られる Il-1 遺伝子クラスターの多型が、アジア人集団の緑内障患者に対しても保護的であるかどうかを判断したいと考えています。 また、正常血圧緑内障患者と高圧緑内障患者の Il-1 遺伝子クラスターの多型の分布に違いがあるかどうかを判断することも目的としています。 原発性閉塞隅角および原発性開放隅角緑内障患者の両方が研究されます。 この研究は、アジアにおける失明の主な原因であり、IOP 依存性疾患と考えられている PACG のそのような変化を調査する最初の研究となります。 この研究結果は、緑内障の遺伝的基盤に影響を与える可能性があり、IOP応答と緑内障の病因における免疫系の役割に焦点を当てています。 これは、免疫系に関連する多型の役割に関するパイロット研究であり、結果に応じて、緑内障における他の免疫遺伝子の役割に関するより大きな調査に着手する可能性があります。

メソッド

患者募集:

この研究では、シンガポール国立眼科センターの緑内障クリニックから、原発性緑内障の少なくとも 300 人の患者が募集されます。 これは、PACG、POAG、および NTG 患者で構成されます。 緑内障の臨床的証拠のない別の 100 人の対照患者が、一般診療所から募集されます。 二次閉鎖角およびその他の眼疾患のある個人は除外されます。

患者の評価と検査 両眼の検査には、最高矯正スネレン視力、ゴニスコピー、ゴールドマン圧平眼圧計による眼圧測定、前眼部、水晶体、硝子体および網膜の細隙灯検査が含まれます。 さらに、走査型レーザー検眼鏡、ハイデルベルグ網膜断層撮影装置 (HRT、ハイデルベルグ エンジニアリング、ハイデルベルク、ドイツ) を使用して、すべての被験者の視神経乳頭を画像化します。 標準参照面を使用して、HRT ソフトウェア (バージョン 2.01b) を使用して、グローバルおよびセグメントの椎間板およびカップ領域を直接分析します。 リムの面積は、ディスクの面積からカップの面積を差し引いて計算されます。 緑内障の重症度は、視野のグローバル インデックスと HRT 神経網膜縁領域によって分類されます。 軸長も IOL-Master (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Germany) で測定されます。 静脈穿刺により各患者から10mlの血液を採取する。

緑内障の標準化された選択基準が使用されます。これは、互換性のある視野損失を伴う緑内障性視神経症（カップ：ディスク比が0.7以上の神経網膜縁の損失として定義されます）の存在です。 PACG は、緑内障性視神経症の存在を伴う隅角鏡検査で小柱網が見えない少なくとも 180 度の角度の存在として定義されます。 POAG 患者は隅角鏡検査で角度が開きます。日中の検査で一貫して 21 mm Hg 未満である治療なしの平均 IOP を持つ POAG 患者は、NTG として分類されます。

DNA の調製とジェノタイピング

Nucleon DNA 抽出キットを使用して、末梢血の白血球からゲノム DNA を抽出します。 Il-1alpha (-889)、Il-beta (-511)、および Il-1beta (+3953) バリアントは、特定のポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) (表 1のプライマーを使用) によって検出され、続いて制限酵素による消化が行われます。酵素は、表 1 に記載されているように消化します。 多型の確認は、直接配列決定によって行われます。

方法論はかなり簡単で、実験室での作業はアリシア・ハウ博士 (Registrar、SNEC) が毎週の研究セッション中に行うことができます。 Dr How は基本的な分子遺伝学研究室のトレーニングを受けており、Dr Aung Tin の監督下にあります。

表1。 IL-1α（-889）、IL-1β（-511）、IL-1β（+3953）のプライマー配列、PCR条件、酵素

多型性 プライマー配列 アニーリング温度 (oC) 酵素 期待される DNA 産物 (bp) IL-1alpha (-889) フォワード 5'-GCATGCCATCACACCTAGTT-3' 58 Nco1 C:194 リバース 5'-TTACATATGAGCCTTCCATG-3' T:178,16 IL- 1beta (-511) Forward 5'-TGGCATTGATCTGGTCATC-3' 60 Bsu36I, C:304 Reverse 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3' T:190,114 IL-1beta (+3953) Forward 5'-GTTGTCATCAGACTTTGACC-3' 60 TaqI, C: 135,114 逆 5'-TTCAGTTCATATGGACCAGA-3' T:249