Ruolo dei polimorfismi nel cluster genico IL-1

Obiettivi:

Obiettivo primario: indagare se i polimorfismi nel cluster del gene Il-1 sono protettivi per il glaucoma nelle popolazioni asiatiche.

Obiettivo secondario: determinare se ci sono differenze nei polimorfismi a singolo nucleotide del cluster del gene Il-1 nei pazienti con glaucoma normoteso rispetto ai pazienti con glaucoma ad alta pressione.

Sfondo

I glaucomi sono un gruppo di neuropatie ottiche eterogenee caratterizzate dalla progressiva perdita di assoni nel nervo ottico. Sulla base della banca dati globale dell'OMS sulla cecità, il glaucoma rappresenta 5,1 milioni dei 38 milioni stimati di non vedenti nel mondo.1Glaucoma colpisce circa 70 milioni di persone in tutto il mondo ed è la principale causa di cecità irreversibile nel mondo2. Poiché il numero di anziani nel mondo aumenta rapidamente, la morbilità del glaucoma aumenterà, causando un aumento dei costi sanitari e dell'onere economico. Ciò ha importanti implicazioni per la salute pubblica per una condizione in cui la perdita della vista, una volta stabilita, non può essere invertita. Il principale fattore di rischio nel glaucoma è l'elevata pressione intraoculare dovuta alla riduzione del deflusso acqueo.

Precedenti studi hanno dimostrato che il glaucoma è una delle principali cause di morbilità visiva a Singapore3-5. In un sondaggio basato sulla popolazione condotto tra i cinesi di Singapore nel distretto di Tanjong Pagar, la prevalenza standardizzata per età del glaucoma è risultata essere del 3,2% (intervallo di confidenza al 95%, 2,3-4,1) nella popolazione di età pari o superiore a 40 anni.3

Il glaucoma ha un'importante base genetica, che si stima rappresenti un terzo (intervallo 20-60%) di tutti i casi di glaucoma, 6-8 sebbene un rapporto recente suggerisca che si tratta di una sottostima.9 L'eterogeneità genetica è illustrata dagli oltre 15 loci e 7 geni che causano il glaucoma identificati fino ad oggi, 10 inclusi 2 geni identificati per POAG.11-12 È stata trovata una varietà diversificata di meccanismi genetici che inducono glaucomi ad angolo aperto e dello sviluppo e questi includono mutazioni codificanti, in particolare nei fattori di trascrizione, 13 dosaggio genico alterato 14 ed effetti negativi dominanti. 15

L'interleuchina-1 è un importante mediatore dell'infiammazione. Ci sono 2 citochine pro-infiammatorie, Il-1 alfa e Il-1 beta. Entrambi sono prodotti da monociti, macrofagi e cellule epiteliali come risposta dell'ospite al danno tissutale. I geni che codificano per Il-1 si trovano all'interno di una regione di 430 kb sul cromosoma 2q14.216. È stato dimostrato che i polimorfismi del cluster del gene Il-1 alterano l'espressione della proteina. I polimorfismi a singolo nucleotide sono stati collegati ad altre malattie come la preeclampsia tra le altre condizioni mediche17.

_L'espressione della molecola-1 di adesione dei leucociti endoteliali (ELAM-1) nelle cellule del reticolo trabecolare è stata identificata come un marcatore diagnostico del glaucoma18. _L'espressione di ELAM-1 è controllata dall'attivazione del ciclo di feedback autocrino Il-1, che è controllato attraverso il fattore di trascrizione NF-Kappa -Beta. È stato dimostrato che l'Il-1 prodotto endogenamente dalle cellule glaucomatose inibisce la risposta apoptotica allo stress ossidativo18. È stato anche riportato che Il-1 aumenta la facilità di deflusso stimolando l'espressione degli enzimi metalloproteinasi della matrice, che a sua volta riduce la resistenza extracellulare19-22. L'effetto dell'Il-1 sulla sintesi dell'ossido nitrico che causa un rilassamento del tono muscolare ciliare può anche contribuire all'aumento del deflusso acquoso23.

Recentemente, Wang et al. hanno dimostrato che le varianti di Il-1 determinano un aumento della secrezione di Il-1 e quindi riducono il rischio di glaucoma primario ad angolo aperto (POAG) 24. Questo è stato presentato al recente meeting ARVO 2005 in Florida, USA, sotto "Nuove idee nel glaucoma". Il gruppo guidato dalla dott.ssa Elizabeth Fini del Bascom Palmer Eye Institute, Miami, ha identificato varianti genetiche (+3953T) dell'Il-1β, che è un fattore protettivo contro il POAG. Hanno valutato il DNA genomico di 100 pazienti POAG e 104 controlli normali nella popolazione caucasica di oltre 40 anni. La frequenza allelica di Il-1 Beta (+3953T) era significativamente più alta nei controlli normali rispetto al gruppo POAG (28% contro 17%, p=0,01). Hanno anche scoperto che la frequenza dell'allele di Il-1 alfa (-889T) era più alta nei controlli normali rispetto al gruppo POAG al limite di significatività (39% contro 29%, p=0,06). Ciò può rivelarsi significativo con una dimensione del campione più ampia.

In questo progetto, speriamo di determinare se i polimorfismi nel cluster del gene Il-1 trovato nei caucasici sono protettivi anche per i pazienti affetti da glaucoma nelle popolazioni asiatiche. Miriamo anche a determinare se ci sono differenze nella distribuzione dei polimorfismi del cluster del gene Il-1 nei pazienti con glaucoma normotensivo rispetto ai pazienti con glaucoma ad alta pressione. Saranno studiati sia i pazienti con glaucoma primario ad angolo chiuso che quello con glaucoma primario ad angolo aperto. Lo studio sarà il primo a indagare su tali cambiamenti nel PACG, una delle principali cause di cecità in Asia, e considerata una malattia IOP-dipendente. I risultati dello studio possono avere implicazioni sulle basi genetiche del glaucoma, ponendo l'accento sul ruolo del sistema immunitario nella risposta IOP e nella patogenesi del glaucoma. Questo è uno studio pilota sul ruolo dei polimorfismi correlati al sistema immunitario e, a seconda dei risultati, potremmo intraprendere un'indagine più ampia sul ruolo di altri geni immunitari nel glaucoma.

Metodi

Reclutamento dei pazienti:

Almeno 300 pazienti con glaucoma primario saranno reclutati nello studio dalle cliniche del glaucoma presso il Singapore National Eye Centre. Questo sarà composto da pazienti PACG, POAG e NTG. Ci saranno altri 100 pazienti di controllo senza evidenza clinica di glaucoma reclutati dalle cliniche generali. Saranno esclusi gli individui con chiusura secondaria dell'angolo e altre malattie oculari.

Valutazione ed esame del paziente L'esame, di entrambi gli occhi, includerà l'acuità visiva di Snellen con la migliore correzione, goniscopia, misurazione della pressione intraoculare mediante tonometro ad applanazione di Goldmann, esame con lampada a fessura del segmento anteriore, cristallino, vitreo e retina. Inoltre, verrà utilizzato un oftalmoscopio laser a scansione, il tomografo della retina di Heidelberg (HRT, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germania) per l'immagine del disco ottico in tutti i soggetti. Le aree globali e segmentali del disco e della coppa saranno analizzate direttamente mediante il software HRT (versione 2.01b) utilizzando il piano di riferimento standard. L'area del bordo verrà calcolata sottraendo l'area della coppa dall'area del disco. La gravità del glaucoma sarà classificata in base agli indici globali nei campi visivi e all'area della rima neuroretinica HRT. La lunghezza assiale sarà misurata anche con IOL-Master (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Germania). Saranno prelevati 10 ml di sangue da ciascun paziente mediante prelievo venoso.

Verranno utilizzati criteri di inclusione standardizzati per il glaucoma, ovvero la presenza di neuropatia ottica glaucomatosa (definita come perdita del bordo neuroretinico con un rapporto coppa:disco di 0,7 o superiore) con perdita del campo visivo compatibile. PACG sarà definito come la presenza di almeno 180 gradi di angolo in cui il trabecolato non è visibile alla gonioscopia con la presenza di neuropatia ottica glaucomatosa. I pazienti POAG avranno angoli aperti alla gonioscopia; I pazienti POAG con una PIO media senza trattamento che è costantemente inferiore a 21 mm Hg nei test diurni saranno classificati come NTG.

Preparazione del DNA e genotipizzazione

Il DNA genomico sarà estratto dai leucociti del sangue periferico utilizzando i kit di estrazione del DNA Nucleon. Le varianti Il-1alpha (-889), Il-beta (-511) e Il-1beta (+3953) saranno rilevate mediante specifica reazione a catena della polimerasi (PCR) (utilizzando i primer nella Tabella 1), seguita da digestione con restrizione l'enzima digerisce come descritto nella Tabella 1. La conferma dei polimorfismi verrebbe effettuata mediante sequenziamento diretto.

La metodologia è abbastanza semplice e il lavoro di laboratorio può essere eseguito dalla dott.ssa Alicia How (Registrar, SNEC) durante la sua sessione di ricerca ogni settimana. Il dottor How ha seguito un corso di laboratorio di genetica molecolare di base e sarà supervisionato dalla dottoressa Aung Tin.

Tabella 1. Sequenza di primer, condizione PCR ed enzima per IL-1α (-889), IL-1β (-511) e IL-1β (+3953)

Polimorfismo Sequenza primer Annealing Temp (oC) Enzima Prodotti del DNA attesi (bp) IL-1alfa (-889) Forward 5'-GCATGCCATCACACCTAGTT-3' 58 Nco1 C:194 Reverse 5'-TTACATATGAGCCTTCCATG-3' T:178,16 IL- 1beta (-511) Avanti 5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3' 60 Bsu36I, C:304 Indietro 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3' T:190,114 IL-1beta (+3953) Avanti 5'-GTTGTCATCAGACTTTGACC-3' 60 TaqI, C: 135,114 Reverse 5'-TTCAGTTCATATGGACCAGA-3' T:249