Rolle von Polymorphismen im IL-1-Gencluster

Ziele:

Primäres Ziel: Untersuchung, ob Polymorphismen im Il-1-Gencluster in asiatischen Populationen vor Glaukom schützen.

Sekundäres Ziel: Bestimmung, ob es Unterschiede in den Einzelnukleotid-Polymorphismen des Il-1-Genclusters bei Patienten mit normotensivem Glaukom im Vergleich zu Patienten mit Hochdruckglaukom gibt.

Hintergrund

Die Glaukome sind eine Gruppe von heterogenen Optikusneuropathien, die durch fortschreitenden Verlust von Axonen im Sehnerv gekennzeichnet sind. Laut WHO Global Data Bank on Blindness entfallen 5,1 Millionen der geschätzten 38 Millionen Blinden weltweit auf das Glaukom.1Glaukom betrifft etwa 70 Millionen Menschen weltweit und ist weltweit die Hauptursache für irreversible Erblindung2. Da die Anzahl älterer Menschen weltweit rapide zunimmt, wird die Glaukommorbidität zunehmen, was zu erhöhten Gesundheitskosten und wirtschaftlichen Belastungen führen wird. Dies hat wichtige Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit für einen Zustand, bei dem ein einmal festgestellter Sehverlust nicht rückgängig gemacht werden kann. Der Hauptrisikofaktor beim Glaukom ist ein erhöhter Augeninnendruck aufgrund einer Verringerung des Kammerwasserabflusses.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Glaukom eine der Hauptursachen für visuelle Morbidität in Singapur ist3-5. In einer bevölkerungsbasierten Umfrage, die unter chinesischen Singapurern im Distrikt Tanjong Pagar durchgeführt wurde, wurde festgestellt, dass die altersstandardisierte Prävalenz des Glaukoms 3,2 % (95 % Konfidenzintervall, 2,3–4,1) in der Bevölkerung ab 40 Jahren beträgt.3

Das Glaukom hat eine wichtige genetische Basis, die schätzungsweise ein Drittel (Bereich 20–60 %) aller Glaukomfälle ausmacht, 6–8, obwohl ein kürzlich veröffentlichter Bericht darauf hindeutet, dass dies eine Unterschätzung ist.9 Die genetische Heterogenität wird durch mehr als 15 Loci und 7 Glaukom-verursachende Gene veranschaulicht, die bisher identifiziert wurden, 10 einschließlich 2 Gene, die für POAG identifiziert wurden.11-12 Es wurde festgestellt, dass eine Vielzahl von genetischen Mechanismen Offenwinkel- und Entwicklungsglaukom induzieren, und dazu gehören codierende Mutationen, insbesondere in Transkriptionsfaktoren, 13 veränderte Gendosierung14 und dominante negative Auswirkungen.15

Interleukin-1 ist ein wichtiger Entzündungsmediator. Es gibt 2 entzündungsfördernde Zytokine, Il-1 alpha und Il-1 beta. Beide werden von Monozyten, Makrophagen und Epithelzellen als Wirtsreaktionen auf Gewebeverletzungen produziert. Die Gene, die Il-1 codieren, befinden sich innerhalb einer 430-kb-Region auf Chromosom 2q14.216. Es wurde gezeigt, dass Polymorphismen des Il-1-Genclusters die Proteinexpression verändern. Einzelnukleotid-Polymorphismen wurden unter anderem mit anderen Krankheiten wie Präeklampsie in Verbindung gebracht17.

_Die Expression des endothelialen Leukozyten-Adhäsionsmoleküls 1 (ELAM-1) in Trabekelwerkzellen wurde als diagnostischer Marker für Glaukom identifiziert18. _Die Expression von ELAM-1 wird durch die Aktivierung der autokrinen Rückkopplungsschleife von Il-1 gesteuert, die durch den Transkriptionsfaktor NF-Kappa-Beta gesteuert wird. Es wurde gezeigt, dass Il-1, das von Glaukomzellen endogen produziert wird, die apoptotische Reaktion auf oxidativen Stress hemmt18. Es wurde auch berichtet, dass Il-1 die Ausflussfähigkeit erhöht, indem es die Expression von Matrix-Metalloproteinase-Enzymen stimuliert, was wiederum den extrazellulären Widerstand reduziert19-22. Die Wirkung von Il-1 auf die Synthese von Stickstoffmonoxid, die eine Entspannung des Ziliarmuskeltonus bewirkt, kann ebenfalls zur Erhöhung des Kammerwasserabflusses beitragen23.

Kürzlich haben Wang et al. gezeigt, dass Il-1-Varianten zu einer erhöhten Sekretion von Il-1 führen und somit das Risiko eines primären Offenwinkelglaukoms (POAG) reduzieren 24. Dies wurde auf dem jüngsten ARVO-Treffen 2005 in Florida, USA, unter „Neue Ideen beim Glaukom“ vorgestellt. Die Gruppe unter der Leitung von Dr. Elizabeth Fini vom Bascom Palmer Eye Institute, Miami, identifizierte genetische Varianten (+3953T) des Il-1 β, das ein Schutzfaktor gegen POAG ist. Sie bewerteten die genomische DNA von 100 POAG-Patienten und 104 normalen Kontrollpersonen in der kaukasischen Bevölkerung über 40 Jahre. Die Allelhäufigkeit von Il-1 Beta (+3953T) war bei normalen Kontrollen signifikant höher als in der POAG-Gruppe (28 % gegenüber 17 %, p = 0,01). Sie fanden auch heraus, dass die Allelhäufigkeit von Il-1 alpha (-889T) bei normalen Kontrollen höher war als in der POAG-Gruppe bei grenzwertiger Signifikanz (39 % gegenüber 29 %, p = 0,06). Dies kann sich bei einer größeren Stichprobengröße als signifikant erweisen.

In diesem Projekt hoffen wir festzustellen, ob Polymorphismen im Il-1-Gencluster, die bei Kaukasiern gefunden wurden, auch Glaukompatienten in asiatischen Populationen schützen. Wir wollen auch feststellen, ob es Unterschiede in der Verteilung von Polymorphismen des Il-1-Genclusters bei Patienten mit normotensivem Glaukom im Vergleich zu Patienten mit Hochdruckglaukom gibt. Es werden sowohl Patienten mit primärem Winkelverschluss als auch mit primärem Offenwinkelglaukom untersucht. Die Studie wird die erste sein, die solche Veränderungen im PACG untersucht, einer Hauptursache für Erblindung in Asien, die als IOD-abhängige Krankheit gilt. Die Studienergebnisse könnten Auswirkungen auf die genetischen Grundlagen des Glaukoms haben, wobei der Schwerpunkt auf der Rolle des Immunsystems bei der IOP-Reaktion und der Glaukom-Pathogenese liegt. Dies ist eine Pilotstudie zur Rolle von Polymorphismen, die mit dem Immunsystem in Verbindung stehen, und abhängig von den Ergebnissen können wir mit einer umfassenderen Untersuchung der Rolle anderer Immungene beim Glaukom beginnen.

Methoden

Patientenrekrutierung:

Mindestens 300 Patienten mit primärem Glaukom werden in die Studie aus Glaukomkliniken des Singapore National Eye Centre rekrutiert. Diese besteht aus PACG-, POAG- und NTG-Patienten. Weitere 100 Kontrollpatienten ohne klinische Anzeichen eines Glaukoms werden aus den allgemeinen Kliniken rekrutiert. Personen mit sekundärem Winkelverschluss und anderen Augenerkrankungen werden ausgeschlossen.

Patientenbeurteilung und Untersuchung Die Untersuchung beider Augen umfasst die bestkorrigierte Snellen-Sehschärfe, Goniskopie, Augeninnendruckmessung mit einem Goldmann-Applanationstonometer, Spaltlampenuntersuchung des vorderen Segments, der Linse, des Glaskörpers und der Netzhaut. Zusätzlich wird ein Scanning-Laser-Ophthalmoskop, der Heidelberg Retina Tomograph (HRT, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Deutschland) zur Darstellung der Papille in allen Fächern verwendet. Globale und segmentale Bandscheiben- und Pfannenbereiche werden direkt mittels HRT-Software (Version 2.01b) unter Verwendung der Standard-Referenzebene analysiert. Die Felgenfläche wird berechnet, indem die Schalenfläche von der Scheibenfläche abgezogen wird. Der Schweregrad des Glaukoms wird durch globale Indizes in den Gesichtsfeldern sowie durch den HRT-Bereich des neuroretinalen Randes klassifiziert. Die axiale Länge wird auch mit dem IOL-Master (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland) gemessen. 10 ml Blut werden jedem Patienten durch Venenpunktion entnommen.

Es werden standardisierte Einschlusskriterien für Glaukom verwendet, d. h. das Vorhandensein einer glaukomatösen Optikusneuropathie (definiert als Verlust des neuroretinalen Randes mit einem Cup:Disc-Verhältnis von 0,7 oder mehr) mit kompatiblem Gesichtsfeldverlust. PACG wird definiert als das Vorhandensein eines Winkels von mindestens 180 Grad, in dem das Trabekelwerk in der Gonioskopie bei Vorhandensein einer glaukomatösen Optikusneuropathie nicht sichtbar ist. POAG-Patienten haben bei der Gonioskopie offene Winkel; POAG-Patienten mit einem mittleren IOD ohne Behandlung, der bei täglichen Tests konstant unter 21 mmHg liegt, werden als NTG klassifiziert.

DNA-Präparation und Genotypisierung

Genomische DNA wird aus Leukozyten des peripheren Blutes mit Nucleon DNA-Extraktionskits extrahiert. Die Varianten Il-1alpha (-889), Il-beta (-511) und Il-1beta (+3953) werden durch spezifische Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (unter Verwendung der Primer in Tabelle 1), gefolgt von Verdauung mit Restriktion, nachgewiesen Enzymverdaus, wie in Tabelle 1 beschrieben. Die Bestätigung von Polymorphismen würde durch direktes Sequenzieren durchgeführt werden.

Die Methodik ist ziemlich einfach und die Laborarbeit kann von Dr. Alicia How (Registrarin, SNEC) jede Woche während ihrer Forschungssitzung durchgeführt werden. Dr. How hat eine grundlegende Laborausbildung in Molekulargenetik absolviert und wird von Dr. Aung Tin betreut.

Tabelle 1. Primersequenz, PCR-Bedingung und Enzym für IL-1α (-889), IL-1β (-511) und IL-1β (+3953)

Polymorphismus Primersequenz Annealingtemperatur (oC) Enzym Erwartete DNA-Produkte (bp) IL-1alpha (-889) Vorwärts 5'-GCATGCCATCACACCTAGTT-3' 58 Nco1 C:194 Rückwärts 5'-TTACATATGAGCCTTCCATG-3' T:178,16 IL- 1beta (-511) Vorwärts 5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3' 60 Bsu36I, C:304 Rückwärts 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3' T:190,114 IL-1beta (+3953) Vorwärts 5'-GTTGTCATCAGACTTTGACC-3' 60 TaqI, C: 135,114 Rückwärts 5'-TTCAGTTCATATGGACCAGA-3' T:249